稳定分化软骨前体细胞株的建立与鉴定及其NMR波谱和材料相容性研究

摘要

本文旨在建立分离培养和鉴定大鼠骨骺生长板软骨细胞亚群的实验方法，探讨其静止区软骨细胞的生物学特性；并通过基因工程技术，诱导静止区骺软骨细胞稳定分化，筛选稳定分化株，研究其基因和蛋白质表达，监测细胞表面的代谢变化和细胞内离子浓度，全面评估其遗传特征保存情况；分析稳定分化软骨前体细胞与纳米组织工程材料的复合黏附特性及其增殖分化的变化。本课题深入研究骨骺软骨细胞增殖、分化规律，为人工调控骨与软骨的生长和通过现代组织工程技术修复软骨的研究建立实验基础。 通过显微外科技术解剖大鼠长骨骨骺生长板软骨，酶消化法获得分散的单细胞悬液；采用percoll不连续密度梯度离心法分离生长板细胞亚群，分层培养、观察不同层细胞形态，并进行细胞生长动力学分析，电子显微镜观察细胞超微结构，组织化学和免疫细胞化学方法检测不同细胞FGFR-3、X和Ⅱ型胶原的表达。利用获得的骨骺生长板增殖区软骨细胞亚群，提取总RNA，RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA，扩增后经纯化、双酶切连接到真核表达载体pEGFP-IRES2；转化扩增后提取重组质粒pEGFP-IRES2-PTHrp，进行酶切鉴定和序列测定。利用脂质体介导的基因转染技术将含有PTHrp基因的重组质粒转染至原代培养的新生大鼠软骨前体细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养传代。应用FGFR-3、Ⅱ型胶原、X型胶原和PTHrp抗体进行免疫细胞化学鉴定，检测其表型及分化能力，观察细胞的形态及其生长状况，绘制细胞生长曲线。用RT-PCR、Southernblot和westemblot从不同层次鉴定PTHrp基因在转染细胞中的表达。以重水(D2O)缓冲液重悬传代培养的稳定分化软骨前体细胞，在灌流条件下，利用inova600型液态核磁共振谱仪测定细胞的31P-NMR波谱，和细胞内游离Mg2+浓度，观察波谱组成及各波峰高度，评价细胞代谢情况。尝试细胞与nanoHA/PDLLA多孔材料复合培养7天后，进行形态学观察和扫描电镜观察及MTT测定，了解细胞增殖及黏附情况，获得了稳定分化骨骺干细胞与组织工程材料的相容性、黏附性的初步资料。 我们获得了四层生长板软骨细胞亚群，细胞活性达到了95％以上；原代培养细胞呈多角形，第8代细胞仍保持多角的形态；前4代细胞的每日倍增指数随着传代次数的增加而增加，第8代后显著降低。依照细胞成熟程度，体积逐渐增大，密度逐层减小；软骨前体细胞表面有FGFR-3的表达，其他层细胞均为阴性；随着细胞的逐渐成熟，Ⅱ型胶原表达逐渐减弱，而X型胶原的表达逐渐增强；随着传代次数增加阳性细胞的比例下降。从增殖区细胞提取的总RNA纯度、含量均符合要求，RT-PCR和PCR产物电泳可在预期大小处得到清晰条带，酶切、连接、转化后获得2株阳性转化大肠杆菌，大提产物经限制性内切酶酶切图谱分析可得到目的基因条带和载体条带，DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。将重组质粒转染入软骨前体细胞后获得1个阳性细胞克隆，免疫细胞化学证实为具有较强增值能力和多分化潜能。经Southem印迹杂交和Western证实，PTHrp已稳定转染入软骨前体细胞，表达其mRNA及其蛋白。转染细胞经扩大培养，命名为稳定分化软骨前体细胞(immortalizedprecartilaginousstemcell，IPSC)。贴壁培养的IPSC，群体倍增时间为22.92h，传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。本实验成功获得稳定分化软骨前体细胞株31p-NMR波谱，发现其由PCr、ATP、Pi等五个共振峰组成，细胞内游离Mg2+浓度为0.326mmol/L。稳定分化软骨前体细胞与nanoHA/PDLLA多孔材料具有良好的相容性，细胞在材料上生长良好，材料对细胞增殖无不良影响，为进一步应用研究研究打下基础。 通过上述研究，我们发现能够通过密度梯度离心法分离骨骺生长板细胞亚群，并可以获得四个高纯度、高活性的软骨细胞亚群。第4代以前细胞表型稳定，可以作为研究软骨增殖分化调控的细胞平台。从骨骺生长板增殖区软骨细胞亚群中克隆PTHrp基因构建其真核表达载体，可诱导软骨前体细胞稳定分化。稳定分化软骨前体细胞的31P-NMR波谱形态正常，代谢正常，内环境稳定；细胞与nanoHA/PDLLA多孔材料相容性良好，黏附能力强。本实验所获得的稳定分化软骨前体细胞株为骺软骨细胞的实验研究及其介导的细胞移植治疗提供了稳定的细胞来源。为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了良好的基础，可望成为一种新的治疗手段。 第一章骨骺细胞亚群的分离鉴定和生物学性状研究 目的：分离培养并鉴定大鼠骨骺生长板软骨细胞亚群，探讨各亚群生物学特性，为研究软骨细胞增殖分化的调控和软骨组织工程修复的研究建立实验基础。方法：显微解剖大鼠长骨骨骺生长板软骨，酶消化法获得分散的单细胞悬液。采用percoll不连续密度梯度离心法分离生长板细胞亚群，分层培养、观察不同层细胞形态，并进行细胞生长动力学分析，电子显微镜观察细胞超微结构，组织化学和免疫细胞化学方法检测不同细胞FGFR-3、X和Ⅱ型胶原的表达。结果：我们获得了四层生长板软骨细胞亚群，细胞活性达到了95％以上；原代培养细胞呈多角形，第8代细胞仍保持多角的形态；前4代细胞的每日倍增指数随着传代次数的增加而增加，第8代后显著降低。依照细胞成熟程度，体积逐渐增大，密度逐层减小；前体细胞表面有FGFR-3的表达，其他层细胞为阴性；随着细胞的逐渐成熟，Ⅱ型胶原表达逐渐减弱，而X型胶原的表达逐渐增强；随着传代次数增加阳性细胞的比例下降。结论：骨骺生长板存在四个不同细胞亚群，并能够通过密度梯度离心法分离，可以获得高纯度、高活性的软骨细胞亚群。第4代前的细胞表型稳定，可以作为研究软骨增殖分化调控的细胞平台。 第二章PTHrp基因的克隆和真核表达载体的构建 目的：从大鼠骨骺生长板软骨细胞增殖区亚群中克隆PTHrp基因并构建其真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。方法：Percoll不连续密度梯度离心法分离大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞，提取总RNA，用RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA，经PCR扩增，产物回收纯化、双酶切后连接到真核表达载体pEGFP-IRES2；转化扩增后提取重组质粒pEGFP-IRES2-PTHrp，进行酶切鉴定和序列测定。结果：总RNA纯度、含量均符合要求；PCR产物电泳可在预期大小处得到清晰条带，连接转化后获得2株阳性转化大肠杆菌，大提产物经限制性内切酶酶切图谱分析可得到目的基因条带和载体条带，DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论：准确从骨骺生长板增殖区软骨细胞中克隆了PTHrp基因成功构建其真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp，为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了良好的基础。 第三章稳定分化软骨前体细胞株的建立及鉴定 目的：建立稳定分化大鼠骨骺软骨前体细胞株，为细胞移植治疗和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法：利用脂质体介导的基因转染技术将含有甲状旁腺激素相关肽(parathroidhormone-relatedpeptide，PTHrp)基因的重组质粒pEGFP-IRES2-PTHrp转染至原代培养的新生大鼠软骨前体细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养传代。应用FGFR-3、Ⅱ型胶原、X型胶原和PTHrp抗体进行免疫细胞化学鉴定，检测其表型及分化能力，观察细胞的形态及其生长状况，绘制细胞生长曲线。用RT-PCR、Southernblot和westernblot从不同层次鉴定PTHrp基因在转染细胞中的表达。结果：转染后获得1个阳性细胞克隆，免疫细胞化学证实为具有较强增值能力和多分化潜能的软骨前体细胞。经Southern印迹杂交和Western证实，PTHrp已稳定转染入软骨前体细胞，表达其mRNA及其蛋白。转染细胞经扩大培养，命名为稳定分化软骨前体细胞(immortalizedprecartilaginousstemcell，IPSC)。贴壁培养的IPSC，群体倍增时间为23.52h，传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论：PTHrp基因导入可诱导软骨前体细胞稳定分化，为骨骺软骨细胞的实验研究及其介导的细胞移植治疗提供了稳定的细胞来源。 第四章稳定分化软骨前体细胞株的NMR波谱及其与纳米组织工程材料相容性研究 目的：研究稳定分化软骨前体细胞株细胞代谢情况和测定细胞内离子浓度；观察细胞株与的纳米组织工程材料相容性，以及材料对细胞增殖、分化的作用的影响。方法：以重水(D2O)缓冲液重悬传代培养的稳定分化软骨前体细胞，在灌流条件下，利用inova600型液态核磁共振谱仪测定细胞的31p-NMR波谱，和细胞内游离Mg2+浓度，观察波谱组成及各波峰高度，评价细胞代谢情况。细胞与nanoHA/PDLLA多孔材料复合培养7天后，进行形态学观察和扫描电镜观察及MTT测定，了解细胞增殖及黏附情况。结果：成功获得稳定分化软骨前体细胞株31P-NMR波谱，由PCr、ATP、Pi等五个共振峰组成，细胞内游离Mg2+浓度为0.326mmol/L，为进一步研究打下基础。稳定分化软骨前体细胞与nanoHA/PDLLA多孔材料具有良好的相容性，细胞在材料上生长良好，材料对细胞增殖无不良影响。结论：稳定分化软骨前体细胞的31p-NMR波谱形态正常，代谢稳定；细胞与nanoHA/PDLLA多孔材料相容性良好，黏附能力强，可望成为新的治疗手段。

目录

缩略词表

前 言

摘 要

第一章骨骺细胞亚群的分离鉴定和生物学性状研究

第二章PTHrp基因的克隆和真核表达载体的构建

第三章稳定分化软骨前体细胞株的建立及鉴定

第四章稳定分化软骨前体细胞株的NMR波谱及其与纳米组织工程材料相容性研究

综述软骨细胞发育与调控的相关研究

附 录：博士在读期间发表的论文及科研情况

致 谢