单纯FSH缺陷症——FSH野生型及β亚基p.Arg97X突变型体外验证实验

摘要

目的：
　　通过构建pcDNA3.1（+）-FSHα质粒，进行FSHα及β亚基共转染，从转录、翻译及蛋白质水平，判断该突变位点是否会影响FSH的转录、翻译、空间结构和生物学功能，为进一步研究FSH的生理功能，提供天然模型。
　　方法：
　　1、设计引物：根据在NCBI中查到人FSHα亚基的核酸序列设计引物。
　　2、基因扩增：以人体子宫肌瘤组织中提取的RNA为模版，根据上文设计的引物，进行基因扩增，以获取FSHα基因片段。
　　3、载体构建：构建pcDNA3.1(+)-FSHα载体（质粒3）。β亚基突变型质粒载体pcDNA3.1（+）-FSHβ（MU）（质粒1）及野生型质粒pcDNA3.1（+）-FSHβ（WT）（质粒2）均已制备。
　　4、细胞培养及共转染：分成三个组，MU组突变组：拟转染质粒1+质粒3，WT组野生组：拟转染质粒2+质粒3，CK组空白组：拟转染空白pcDNA3.1（质粒4）。将拟转染质粒瞬时共转染进中国仓鼠卵巢细胞内。
　　5.转染细胞裂解液的处理：48小时后，提取细胞裂解液行PCR及western-blot检测。6.转染上清液的处理：①取上清液,增加空白对照组（完全培养基，为MEDIA组）检测FSH的免疫活性。②取上清液，分别处理人卵巢颗粒肿瘤细胞，增加空白对照组（添加完全培养基，为MEDIA组）。③处理6小时后，测定细胞裂解液中cAMP的浓度。
　　结果：
　　1、WT组、MU组分别检测到了FSHα、野生型FSHβ和突变型FSHβ的mRNA；CK组未检测到FSHα和β的mRNA。
　　2、WT组和MU组细胞裂解液检测到了FSH的表达，CK组未检测到蛋白表达。
　　3、WT组检测到上清液高水平的FSH，显著高于其余三组。
　　4、WT组细胞裂解液cAMP浓度显著性高于其余三组，其余三组之间无显著性差异。
　　结论：
　　1、pcDNA3.1(+)-FSHα载体构建成功。FSHα、野生型FSHβ和突变型FSHβ基因均可在细胞内成功转录和翻译。
　　2、上清液中可以检测到野生型 FSH的免疫活性，结合前期实验，确定在体外时只有当α及β亚基结合后，FSH才能被能分泌出胞外，发挥免疫及生物学功能。
　　3、p.Arg97X突变在体外不影响 FSHβ亚基的转录和翻译，但是在细胞外检测不到突变FSH的免疫活性和生物活性，说明该突变位点影响了FSH形成正确的二聚体结构，进而影响了FSH免疫及生物学功能的发挥。

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封面

声明

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中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

1、实验方法

2、主要试剂

3、主要仪器

4. 统计学分析

结果

1 FSHα质粒载体构建

2.RNA 及 PCR 结果

3．werstern blot图片

4 .细胞上清中FSH免疫活性的检测

讨论

结论

参考文献

综述: 促性腺激素遗传性疾病

中英文对照缩略词表

致谢