CaMKⅡ调控心肌病患者心肌脂肪酸代谢的初步研究

摘要

目的：了解Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）在缺血性心肌病和扩张性心肌病（DCM）患者心肌中的变化及其与心肌脂肪酸（FA）代谢关系;于细胞水平研究 CaMKⅡ对心肌细胞脂肪酸摄取和氧化的影响及机制。
　　方法：1.收集就诊于心外科接受心脏移植手术的缺血性心肌病患者、扩张性心肌病（DCM）患者心脏组织及供体来源正常心脏组织。提取左心室心梗边缘缺血区心肌组织蛋白，Western Blot检测 Total CaMKⅡ、Thr287-CaMKⅡ、Total AMPK、Thr172-AMPK、FAT/CD36、Total ACC、Ser79-ACC及MCD蛋白表达变化。2.乳鼠心肌细胞培养及缺氧诱导：取1-3天的C57乳鼠心脏，胰酶和胶原酶进行酶解，细胞悬液以适量密度种入培养瓶，差速培养2小时。收集培养基中未贴壁的心肌细胞，加入含有5-溴脱氧尿嘧啶的培养基培养48小时备用。分别加入 CaMKⅡ抑制剂 KN93及其对照化合物KN92，Con组、KN92组、KN93组在含有95%N2和5%O2的培养箱中诱导心肌细胞缺氧模型。提取心肌细胞蛋白， Western Blot检测无缺氧状态、缺氧20min和缺氧2h后心肌 Total CaMKⅡ、Thr287-CaMKⅡ、Total AMPK、Thr172-AMPK、FAT/CD36、Total ACC、Ser79-ACC及MCD蛋白表达变化。
　　结果：1.Western Blot检测缺血性心肌病患者和 DCM患者左心室心脏蛋白显示：缺血性心肌病患者心脏中的CaMKⅡ Thr-287位点的磷酸化程度较正常人高65％（P＜0.05），两组之间总 CaMKⅡ的表达水平是相近的（P＞0.05）；总的AMPK表达量增高（P＜0.05），Thr-172位点磷酸化程度与正常人相比无明显差异；MCD水平升高（P＜0.05）；总ACC无明显改变；Ser-79位点磷酸化ACC、FAT/CD36表达与正常人相比呈上升趋势，但差异无统计学意义。DCM患者心脏总 CaMKⅡ水平、Thr-287位点磷酸化水平与正常人相比基本不变；总 AMPK表达升高（P＜0.01），Thr-172位点磷酸化水平也升高（P＜0.01）；MCD表达升高（P＜0.01）；FAT/CD36表达量、总ACC、Ser79-ACC磷酸化水平均无明显改变。2.Western Blot检测乳鼠心肌细胞蛋白显示：Con组、KN92组、KN93组总AMPK在无缺氧状态、缺氧20min和缺氧2h时两两之间表达水平均无差异；无缺氧状态下，三组之间Thr172-AMPK磷酸化水平无差异，缺氧20min后KN93组比Con组、KN92组表达下降，KN93组比KN92组下降更明显，缺氧2h时KN93组相比于其他两组表达仍然下降，Con组、KN92两组无差异；无缺氧状态下，三组之间FAT/CD36表达水平无差异，缺氧20min后KN93组相比于Con组、KN92组表达下降（P＜0.05），缺氧2h时KN93组表达仍然低于其他两组；三组总ACC表达在无缺氧状态、缺氧20min和缺氧2h时两两之间表达水平均无差异；无缺氧状态下，三组之间 Ser79-ACC表达无差异，缺氧20min KN93组相比于Con组、KN92组表达呈下降趋势，缺氧2h时下降更明显（P＜0.05）；三组MCD表达水平在无缺氧状态、缺氧20min和缺氧2h时两两之间表达水平均无差异。
　　结论：CaMKⅡ可能参与调控心肌缺血缺氧时 FA代谢改变。通过磷酸化激活AMPK，一方面促进FAT/CD36对FA的摄取，另一方面抑制ACC活性增强FA氧化。通过抑制CaMKⅡ可能下调心肌AMPK调控的FA代谢信号通路，改善缺血心脏功能。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

材料和方法

1 实验材料

1.1 主要实验仪器

1.2 主要耗材

1.3 主要试剂

1.4 主要试剂的配制

2 实验方法

2.1人体心脏组织标本收集

2.2乳鼠心肌细胞分离培养

2.3心肌细胞缺氧处理

3 蛋白提取和浓度测定

3.1人体心脏组织总蛋白提取

3.2心肌细胞总蛋白提取

3.3 BCA法测蛋白浓度及配制蛋白体系

4 Western Blot检测蛋白表达水平

4.2 转膜、封闭、抗体孵育及发光成像

5 统计学分析

实验结果

1.缺血性心肌病患者心脏CaMKⅡ、AMPK表达改变

2.缺血性心肌病患者心脏ACC、FAT/CD36、MCD蛋白表达改变

3.DCM患者心脏CaMKⅡ和AMPK表达改变

4.DCM患者心脏FA代谢相关蛋白ACC、FAT/CD36、MCD表达

5.乳鼠心肌细胞经KN93刺激、缺氧处理AMPK表达改变

6.心肌细胞经KN93刺激、诱导缺氧ACC、FAT/CD36、MCD表达

讨论

参考文献

综述:脂毒性心肌病研究进展

致谢