一株产同型半胱氨酸酶菌株的分离及产酶条件研究

摘要

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)即2-氨基-4-巯基丁酸，又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，是甲硫氨酸(Met)代谢的中间产物。近年来，人们日益注意到人体内的Hcy水平与健康之间的关系密切。Hcy作为一个独立的心血管疾病的风险指标已被广泛接受。Hcy的测定对预防和治疗心血管疾病和其他与Hcy水平相关的疾病有重要的临床意义。目前，血浆Hcy的测定主要采用高效液相色谱技术(HPLC)及荧光偏振免疫技术来进行，但由于时间和价格因素，这些方法仅在大医院或检验中心应用。而酶促比色法与以上方法相比具有更便宜、简捷的特点，因此如能应用于同型半胱氨酸的测定，将是一种更理想的方法。 在酶促比色法中，同型半胱氨酸酶(EC4.4.1.2)是所需要的一个必需的酶，因此它的性质对该方法的使用和推广非常重要。虽然已有少量文献对此类酶进行了报道，但在这些已报道的酶中，大多数都存在着专一性不高的问题。 本研究从土壤中分离筛选到一株产同型半胱氨酸酶菌株N2-1，对其进行了系统地分类学鉴定，并研究了该菌株产同型半胱氨酸酶的发酵条件，对粗酶的一些性质进行了研究。主要实验结果如下： 1、菌株的筛选及鉴定经过富集培养划线分离纯化后，得到5株产同型半胱氨酸酶菌株，通过对酶活性和专一性的分析，菌株N2-1表现出较高的同型半胱氨酸酶活性和专一性，因此确定菌株N2-1为最佳产酶菌株。通过对该菌株的形态学观察，生理生化特性测定及16SrDNA测序和系统发育分析，确定菌株N2-1属于沙雷氏菌属(Serratiasp.)。 2、菌株产酶发酵研究对菌株N2-1产酶发酵的条件进行了研究。研究采用摇瓶培养试验，以测定菌体生长量、酶活性为指标，确定了该菌株产酶发酵的最佳条件为，培养基组成：0.5％蛋氨酸，4.0％酵母膏，1.4％葡萄糖，0.2％K2HPO4·3H2O，0.05％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，1.0％(v/v)微量元素溶液(5.2％ZnSO4，5.0％FeSO4·7H2O，5.0％CuSO4·7H2O和0.05％MnSO4·H2O)，pH6.5。培养温度30℃，装液量为100ml三角瓶中装20ml培养基，于120rpm转速下恒温培养36h。在上述培养条件下发酵，发酵液的酶活可达0.933(OD670)。 3、粗酶液的性质研究对菌株N2-1的粗酶液的两个重要特性进行了研究。首先是磷酸吡哆醛(PLP)对酶活的影响，发现加入10μmol/LPLP可以提高活性35％，而对半胱氨酸酶活性提高达167％。其次是粗酶液的热稳定性试验，发现其中的同型半胱氨酸酶活性和半胱氨酸酶活性具有两条截然不同的曲线，且同型半胱氨酸酶活性在45℃处理10min基本稳定，在50℃处理10min剩余酶活74％。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

第二章产同型半胱氨酸酶菌株的分离与鉴定

第三章菌株N2-1产酶的发酵条件研究

第四章结论与展望

参考文献

硕士学习期间文章发表情况：

致谢