水稻条纹病毒基因的原核表达及NS3和NSvc4的功能研究

摘要

水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻条纹叶枯病近年来在我国广大水稻产区爆发流行，对水稻生产造成了严重损失。由于该病毒病是由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus)以循徊增殖型方式传播，并能经卵传毒，因此防治上较为困难。为了弄清水稻条纹病毒的致病机理，本论文对RSV的几个基因进行了原核表达，并对NS3和NSvc4蛋白的功能开展了研究。 利用大肠杆菌系统pET系列载体表达了RSV的NS2、NS3、NSvc4和SP基因，以Ni2+-NTA agarose亲和柱分别纯化了这四个蛋白与His组氨酸的融合蛋白并制备了相应的抗体。斑点免疫杂交表明，4个抗体均能用于检测发病的水稻叶片和带毒灰飞虱中的相应蛋白。 RNA沉默是一种植物体内固有的抗病毒防卫反应，在防御病毒侵染中起重要作用。农杆菌共浸润转GFP基因本氏烟试验发现RSV编码的蛋白中只有NS3能抑制GFP基因诱导的局部沉默，并且能抑制GFP的系统沉默和沉默信号的系统传导，表明NS3蛋白为RNA沉默的抑制子。进一步用Northern和Western印迹分析证实NS3和GFP共浸润本氏烟6天后局部GFP mRNA和GFP蛋白明显增强。通过检测浸润部位siRNA的积累量发现NS3能够明显减少siRNA的积累。对NS3进行一系列突变后发现NS3蛋白的5'端和3'端都是抑制沉默所必需的。 构建了GFP反向重复结构dsGFP，与GFP和NS3共浸润非转基因的本氏烟，浸润后3天NS3能抑制dsGFP诱导的局部沉默，而此时共浸润GFP与dsGFP的部位已经全部发生沉默。表明NS3能够抑制dsGFP启动的RNA沉默。 利用电泳迁移率变动试验(EMSA)对NS3蛋白与单、双链RNA和siRNA的结合特性进行了分析，发现NS3蛋白能结合单链RNA(ssRNA)而不能结合双链RNA(dsRNA)，与ssRNA的结合能力随着蛋白浓度的增加而增强；NS3蛋白既能与单链siRNA结合也能与双链siRNA结合，说明了NS3蛋白作为抑制子是通过结合siRNA而阻止沉默复合体(RISC)的形成起作用的。 以RSV NS3基因与GFP融合表达载体在洋葱表皮和烟草表皮细胞中对NS3蛋白的亚细胞定位进行了研究。用基因枪法将NS3与GFP融合表达载体导入洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察发现NS3融合蛋白能在细胞质和细胞核中积累，在细胞核中积累量较高。利用农杆菌浸润法将融合表达载体在本氏烟叶片表皮细胞中进行瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察发现NS3融合蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞核内。而将预测的核定位信号序列(NLS，173KKRH176)的三个碱性氨基酸KKR突变为AAA后，突变体无法定位于细胞核中，而是主要定位于细胞质中，暗示了所预测的NLS可能是NS3蛋白的一个功能的核定位信号。用制备的NS3抗体对RSV侵染的水稻叶片中的NS3蛋白进行亚细胞定位，电镜观察发现该蛋白在健康水稻中没有积累，而在病毒侵染的水稻细胞核中表达并积累。 用农杆菌介导的方法将35S启动子驱动的NS3基因转化本氏烟、普通烟和水稻，PCR和Northern印迹分析表明NS3基因已整合入这些转基因株系的基因组中，但没有发现植株生长发育出现任何异常，说明RSV NS3沉默抑制子并不是致病因子。 利用基因枪将运动缺陷型PVX载体与构建的RSV编码基因表达载体共轰击本氏烟叶片，GUS染色后发现只有NSvc4能够互补运动缺陷型PVX的运动功能而在多个细胞间运动；以NSve4与GFP的融合表达载体导入本氏烟表皮细胞，激光共聚焦显微镜下观察发现融合蛋白能够在细胞间运动，表明NSvc4是RSV编码的运动蛋白。通过基因枪轰击NSvc4与GFP的融合表达载体到洋葱表皮细胞中发现融合蛋白定位在细胞核和细胞周质中。同时用农杆菌浸润的方法将融合表达载体浸润本氏烟叶片，共聚焦显微镜下观察发现融合蛋白主要定位在细胞壁上的胞间连丝。用胶体金标记定位发病水稻叶片和转．NSvc4基因水稻叶片中的NSvc4蛋白，发现NSvc4主要定位于细胞壁上，这完全符合运动蛋白的细胞定位特征，也充分说明了NSvc4是运动蛋白。利用酵母双杂交系统对NSvc4与CP间的互作进行了研究，结果发现NSvc4与CP并不能在酵母细胞中进行互作，表明CP可能不是病毒胞间运动所必需的。 利用RT-PCR方法对具有黄色条纹症状的小麦条纹病样品进行了分子鉴定，用RSV几个基因的特异性引物均能扩增到特异性条带，序列分析发现扩到的三个片段(AM397832-34)分别与日本T分离物(NC003754和NC003776)的NS2、NS3和CP基因核苷酸同源性为97.3％、97.5％和97％，氨基酸同源性为99％、97.6％和98.5％。以上结果表明小麦条纹病的病原为水稻条纹病毒。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章文献综述

第一节水稻条纹病毒分子生物学研究进展

1 RSV的基因组结构

2 RSV编码的蛋白及功能

3病毒的进化地位

4存在的问题与展望

第二节病毒编码的RNA沉默抑制子

1 RNA沉默简介

2 RNA沉默是植物中一种固有的抗病毒机制

3 RNA沉默抑制子的发现和多样性

4沉默抑制子的作用方式和抑制沉默的分子机理

5沉默抑制子与病毒病症状形成的关系

6沉默抑制子的应用

7存在的问题与展望

第三节植物病毒编码的运动蛋白

1 MP的几种作用形式

2运动蛋白介导病毒细胞到细胞间运动的分子机制

3运动蛋白在病毒长距离运输中的作用

4运动蛋白介导的植物抗病性

第四节本研究的目的和意义

第二章水稻条纹病毒基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达和抗体制备

1材料与方法

1.1菌株、质粒和抗体

1.2基因的克隆和原核表达载体构建

1.3诱导表达

1.4表达产物在变性条件下的纯化

1.5抗体制备及发病水稻及带毒灰飞虱的检测

2结果与分析

2.1 RSV编码的6个基因的克隆

2.2各基因的序列测定

2.3利用pET-32a载体在大肠杆菌中表达His融合蛋白

2.4蛋白纯化和抗体制备

2.5所制备蛋白多克隆抗体的应用

3讨论

第三章RSV编码的RNA沉默抑制子及作用机制

1材料与方法

1.1材料

1.2载体构建

1.3农杆菌瞬时表达沉默诱导体系的建立和浸润

1.4 GFP荧光观察和拍照

1.5大量提取RNA和Northern印迹分析

1.6 SDS-PAGE电泳和Western印迹分析

1.7信号传导浸润方法

1.8沉默信号回复载体构建和浸润方法

1.9重组蛋白在自然条件下的大量纯化

1.10 GFP RNA的体外转录与探针标记

1.11 siRNA探针标记与纯化

1.12电泳迁移率变动试验(EMSA)

1.13烟草和水稻的遗传转化

1.14转基因烟草和水稻的分子鉴定

1.15 NS3的亚细胞定位

2结果与分析

2.1 RSV编码的NS3能抑制GFP 16c本氏烟的局部沉默

2.3 RSV编码的NS3能抑制非转基因本氏烟的局部沉默

2.4 RSV编码的NS3突变体不能抑制局部沉默

2.5 RSV编码的NS3蛋白可以抑制系统沉默

2.6 NS3蛋白对GFP沉默信号传导的影响

2.7 RSV编码的NS3蛋白不能恢复已建立的沉默

2.8 RSV编码的NS3蛋白与GFP RNA的结合特性

2.9 TRV接种后不能加重病害症状

2.10转NS3基因烟草和水稻的表型观察

2.11 NS3蛋白在细胞中的定位

3讨论

第四章RSV编码的运动蛋白鉴定及其功能初步研究

1材料与方法

1.1材料

1.2载体构建

1.3 GUS染色方法

1.4基因枪轰击方法和共聚焦显微镜观察

1.5亚细胞定位

1.6酵母双杂交载体转化

2结果与分析

2.1利用PVX运动缺陷型载体鉴定运动蛋白

2.2NSvc4与GFP的融合蛋白能在本氏烟细胞间运动

2.3 NSvcA在洋葱表皮细胞中的定位

2.4 NSvc4在烟草表皮细胞中的定位

2.5 NSvc4在感病水稻叶片中的定位

2.6 NSvc4与CP酵母双杂交分析

3讨论

第五章水稻条纹病毒可侵染小麦爆发小麦条纹叶枯病

1材料与方法

1.1病害分离物

1.2植物总RNA的提取、RT-PCR扩增及克隆

1.3 DIBA检测

1.4传毒试验

1.5序列分析

2结果与分析

2.1 DIBA检测结果

2.2 RT-PCR检测、克隆及序列比较

2.3传毒试验

3讨论

附录

博士期间投稿和录用的文章