海底热液口蟹Gandalfus yunohana特异性基因的筛选和功能分析

摘要

本研究采用双链特异性DNA酶介导的均一化消减杂交方法比较了海底热液口蟹Gandalfusyunohana和其在普通条件下生存的近缘种三疾梭子蟹Portunustrituberculatus肝胰腺的mRNA，以探求生物在热液口环境中的生存机制。通过构建全长的均一化cDNA消减文库，在GenBank中比对得到51个与已知基因具有相似性的不同转录本。从这些基因之中，我们选取了硫氧还蛋白基因进行了原核表达系统的构建，并对该基因的完整开放阅读框序列进行了确定、分析与表达产物活性的检测。同时，我们通过RACE的手段获得了G.yunohana的热休克蛋白90基因cDNA的完整序列并进行分析，构建了该基因的原核表达系统并在原核细胞中初步验证了该基因在高温胁迫下对细胞的保护作用。这是首次对海底热液口物种的硫氧还蛋白与热休克蛋白90基因信息的报道，我们得到的数据为今后海底热液口生物在特殊环境下的生存机制的研究奠定了基础。

目录

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致谢

本文主要缩略词表

1 文献综述

1.1 海底热液口与Candalfus yunohana概况

1.2 硫氧还蛋白结构与功能研究

1.2.1 Trx结构特点

1.2.2 硫氧还蛋白系统的组成与功能

1.2.3 Trx的功能概述

1.2.4 Trx结构与功能小结

1.3 热休克蛋白90的结构与功能研究

1.3.1 HsP90家族

l.3.2 真核生物HsP90盼结构分析

1.3.3 HSP90的功能简介

1.3.4 HSP90结构与功能小结

1.4 参考文献

2 海底热液口特有蟹Gandafus yunohana特异性表达基因筛选

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验动物

2.2.2 RNA的抽提

2.2.3 DNSH法筛选差异性表达基因

2.3 结果与讨论

2.3.1 缺氧胁迫相关基因

2.3.2 活性氧自由基胁迫相关基因

2.3.3 高温胁迫相关基因

2.4 小结

2.5 参考文献

3 海底热液口蟹Gandalfus yunohana硫氧还蛋白基因的克隆表达与活性的初步检测

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 Gyu-Trx基因编码区的克隆

3.2.2 pET-28a(+)/Gyu-Trx原核表达系统的构建

3.2.3 Gyu-Trx基因的原核表达

3.2.4 Gym-Trx因表达产物的纯化与复性

3.2.5 Gyu-Trx分子伴侣活性的测定

3.3 实验结果

3.3.1 Gyu-Trx基因编码区的克隆和pEV-28a(+)-Gyu-Vrx原核表达系统的构建

3.3.2 Gyu-Trx全长eDNA与编码氨基酸的分析

3.3.3 Gyu-Trx与不同物种Trx氨基酸序列的比较

3.3.4 Gym-Trx基因原核表达产物的监测

3.3.5 Gyu-Trx基因原核表达产物的纯化

3.3.6 Gyu-Trx的分子伴侣活性

3.4 讨论

3.5 参考文献

4 海底热液口蟹Gandalfus yunohana热休克蛋白90的基因克隆、表达及功能初步研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 Gyu-Hsp90基因拼接序列的获得

4.2.2 Gyu．Hsp90基因编码区的克隆

4.2.3 pET-28a(+)/Gyu-HSP90原核表达系统的构建

4.2.4 Gyu-HSP90基因的原核表达

4.3 结果

4.3.1 Gyu-HSP90基因5’末端序列的获得

4.3.2 Gyu-HSP90原核表达系统的构建

4.3.3 Gyu-HSP90全长eDNA与相应翻译氨基酸的分析

4.3.4 Gyu-HSP90与其它物种同源蛋白质氨基酸序列的比较

4.3.5 Gyu-HSP90基因原核表达产物的检测

4.3.6 Gyu-HSP90基因原核表达产物胞内存在形式的鉴定

4.3.7 Gyu-HSP90基因对Ecoli抗高温胁迫功能的检测结果

4.4 讨途

4.5 参考文献

5 小结与展望

主要创新点

附录

作者简历