靶向HPV16E6/E7共同启动子的siRNA在体内外抑制宫颈癌SiHa细胞生长作用的研究

摘要

宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤中，宫颈癌的发病因素最为明确，高危人乳头瘤病毒(HPV)癌基因E6、E7的过表达是关键和必要的致病因素。HPV16是宫颈癌发病相关最常见的基因型，占所有基因型的50％以上。RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一种有效的基因沉默新技术，其独特的优势超过了其他所有基因沉默技术。目前对RNAi研究主要有转录后水平的沉默和转录水平的基因沉默两个方面。而目前RNAi在宫颈癌上的研究基本集中在HPVE6/E7转录后水平的基因沉默。但由于病毒特有变异能力，探索多个途径基因沉默的研究非常重要。HPV16癌基因E6和E7具有共同的启动子，为RNAi在转录水平同时沉默E6和E7转录提供了可行性，本课题组已经研究了靶向启动子区的体外实验，但迄今尚未见利用RNAi对HPV病毒基因在转录水平沉默的体内研究报道。
　　 本研究拟以含HPV16的宫颈癌细胞株SiHa为研究对象，合成靶向HPV16E6和E7共同启动子的siRNA，以及直接靶向E7的siRNA，将它们分别转入SiHa细胞中，观察癌基因E6、E7的表达情况和细胞的生长情况。进一步以宫颈癌荷瘤动物模型为研究对象，通过用转染siRNA的细胞荷瘤和对野生型细胞荷瘤后再注射siRNA两种方法，检测肿瘤生长情况及病理变化，观察siRNA在实验动物模型中的疗效。旨在探索两种途径的基因沉默在体内外抑制宫颈癌SiHa细胞生长作用，为宫颈癌防治的临床应用打下基础。
　　 第一部分:靶向HPV16E6/E7共同启动子的siRNA抑制官颈癌SiHa细胞生长作用的体外研究
　　 目的：
　　 证实靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA在体外可以抑制官颈癌SiHa细胞的生长。
　　 方法：
　　 选择靶向HPV16E6/E7启动子区和E7编码区的siRNA，并将两种siRNA分别导入宫颈癌细胞株SiHa中，观察癌基因E6和E7表达情况，及细胞的增殖和凋亡情况。
　　 结果：
　　 在体外水平，靶向HPV16E6/E7启动子区和E7编码区的siRNAs均在mRNA水平有效抑制了SiHa细胞E6/E7的表达；在蛋白水平，作为替代的下游靶分子P53分别上调了199％和577％，P16下调了49.5％和44.7％；细胞增殖分别被抑制29.29％和26.19％；细胞凋亡分别提高了161.54％和124.62％。
　　 结论：
　　 靶向HPV16启动子区的siRNA可以有效、同步沉默病毒基因E6和E7，并抑制细胞增殖和诱导其凋亡。
　　 第二部分:靶向HPV16E6/E7共同启动子的siRNA抑制宫颈癌移植瘤生长的研究
　　 目的：
　　 确定靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA能抑制宫颈癌SiHa细胞荷瘤鼠体内移植瘤的生长。
　　 方法：
　　 在裸鼠体内水平，我们设计了两套实验流程，即将siRNA转染后的SiHa注射到BALB/c裸鼠皮下，以及将SiHa直接注射到裸鼠皮下荷瘤然后在瘤内注射siRNA混合制剂，观察肿瘤生长抑制情况，随后将离体的瘤体标本进一步做HE染色，抗Ki-67抗体染色以及TUNEL法检测瘤组织的增殖和凋亡情况。
　　 结果：
　　 1.在干扰后荷瘤实验中，80天后，靶向启动子区和E7编码区的实验组的裸鼠的瘤体积和瘤重均明显小于对照组，瘤体积分别下降了89.7％和64％，瘤重分别轻了4.59倍和2.6倍。
　　 2.荷瘤后注射靶向启动子区和E7编码区的siRNA后，裸鼠的瘤体积和瘤重均明显小于对照组，瘤体积分别下降了29.8％和42.8％，瘤重分别轻了1.65倍和1.45倍。
　　 3.无论是干扰后荷瘤，还是荷瘤后注射siRNA的瘤体组织标本检查结果显示各组Ki-67均没有差异，而各组凋亡却都出现显著差异。
　　 结论：
　　 1.靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA能有效抑制宫颈癌荷瘤鼠体内移植瘤的生长。
　　 2.靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA对移植瘤的体内抑制作用主要是通过诱导细胞凋亡来实现。