BMP2/7异二聚体在诱导种植体周骨缺损区成骨的研究

摘要

近几年来随着口腔科学的发展，口腔种植学得到了很大的发展，但是仍然面临着许多挑战，比如由外伤、老龄化、牙周病等造成的骨量不足情况下的种植。而种植体周围骨的数量和质量对种植体的长期存活起着非常重要的作用，故几种局部的骨再生技术被用来解决种植体周围骨缺损。应用生长因子、多肽、小分子来引导骨组织的再生是其中的方法之一。骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)对骨和软骨的生长有很强的作用，是骨组织工程中最有潜力的一群因子。虽然很多动物实验表明了BMP同源二聚体(如BMP2、BMP7)能有效引导骨的形成，但在临床上的效果不佳，其有效剂量很大。过高的剂量不仅带来昂贵的费用，也带来一系列并发症，如异位成骨，增加破骨细胞的活性，对神经系统的影响等。最近一些研究表明不同的BMP之间存在协同作用，BMP异二聚体比BMP同源二聚体有更好的诱导成骨作用。本研究的目的旨在探讨低浓度的rhBMP2/7异二聚体在种植体周围骨缺损上的诱导成骨作用。
　　 第一部分，种植体周围骨缺损动物模型的建立
　　 目的：
　　 在小型猪的颅骨上建立种植体周围骨缺损的模型，来比较不同rhBMPs的诱导成骨作用。
　　 材料和方法：
　　 18只广西巴马小型猪，平均年龄9个月，体重16.50-19.80公斤，雌雄各半。用直径8mm的空心钻在每只猪的颅骨上制造4个深度为4mm的缺损，每个缺损间隔10mm，缺损中心植入直径3.1mm种植体，植入深度为缺损底部下4mm，然后在种植体周围缺损内分别随机填入rhBMP2/7胶原海绵，rhBMP2胶原海绵，rhBMP7胶原海绵或者空白胶原海绵，表面覆盖Bio-Gide膜(40×50mm)后，分层缝合。
　　 结果：
　　 小型猪颅骨面积和厚度足以支持缺损和种植体，所有种植体固位、生长良好，未见明显松动。胶原海绵，Bio-Gide膜缓慢降解，炎症反应少，在各个观察时间点，均能观察到各组新骨形成的差异。在植入后6周，对照组、rhBMP2组及rhBMP7组均未见到完全的骨愈合。
　　 结论：
　　 小型猪颅骨的种植体周围骨缺损模型术野清楚，操作方便，各缺损的一致性强，受到干扰因素较少，能够将研究重点集中在比较不同rhBMP的性能上。
　　 第二部分，RhBMP2/7异二聚体诱导形成的新骨的微结构分析
　　 目的：
　　 BMP同源二聚体(如BMP2、BMP7)由于其有效使用剂量过高，可能带来较大的经济负担和造成潜在的副作用，而未能在临床普遍应用。近年来有学者通过基因重组表达BMP异二聚体发现其比相应同源二聚体具有更强的诱导成骨作用，但对纯化的BMP异二聚体蛋白治疗研究很少。本实验旨在采用胶原海绵携带纯化的rhBMP2/7异二聚体以及相应的同源二聚体植入种植体周围骨缺损中，并使用Micro-CT来比较rhBMP异二聚体和同源二聚体在体内诱导成骨的质量和数量。
　　 材料和方法：
　　 动物模型同第一部分，分为空白胶原海绵组、胶原海绵携带rhBMP2同源二聚体组、胶原海绵携带rhBMP7同源二聚体组和胶原海绵携带rhBMP2/7异二聚体组。植入后2、3、6周分别处死6只小型猪(n=6/组/时间点)，标本树脂包埋后，用Micro-CT扫描观察，在直接模式(directmodel)下分析了缺损区域的相对骨量(relativebonevolume(BV/TV：％))、骨小梁连接密度(connectivitydensity(Conn.D：1/mm3))，骨小梁数量(trabecularnumber(Tb.N：1/mm3))、骨小梁厚度(trabecularthickness(Tb.Th：mm))、骨小梁之间距离(trabecularseparation(Tb.Sp：mm))和结构模型指数(structuremodeindex(SMI))六个指标。同时，我们扫描分析了猪颅骨未损伤的正常骨组织的上述6个指标作为阳性对照。
　　 结果：
　　 植入后2、3、6周，在BV/TV、Tb.N和Tb.Th指标上，rhBMP2/7组显著高于rhBMP2、7和对照组(p<0.05)，同样rhBMP2、7组也显著高于对照组(p<0.05)；在Tb.Sp和SMI指标上，rhBMP2/7组在每个时间段均为最低，rhBMP2/7组同rhBMP2、7和对照组存在统计学上的差异(p<0.05)，rhBMP2、7组和对照组也存在统计学上的差异(p<0.05)；对照组Conn.D值随着植入时间的增加而增加，其余三组的Conn.D值在植入后3周达到峰值，植入后6周明显下降。植入后6周，rhBMP2/7组的Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和Conn.D跟未损伤正常骨组织不存在统计学上的差别。
　　 结论：
　　 在30ng/mm3的浓度下，rhBMP2、7同源二聚体和rhBMP2/7异二聚体同对照组相比均能促进种植体周围骨缺损的新骨形成，但rhBMY2/7异二聚体同rhBMY2、7同源二聚体相比具有更高的诱导成骨作用，其形成的骨的质量和数量均高于rhBMP2、rhBMP7。
　　 第三部分：RhBMP2/7异二聚体诱导的新骨形成率、骨种植体结合率的研究
　　 目的：
　　 由于Micro-CT为无损伤的检查方法，我们对Micro-CT检查后的标本行进一步硬组织切片检查，以观察缺损区域的组织学行为、新骨形成率(boneareapercentage，BAP)和骨种植体结合率(boneimplantcontact，BIC)。
　　 材料和方法：
　　 动物模型同第一部分。将树脂包埋的标本，行硬组织切片后，再磨至30μm厚度，亚甲基蓝-碱性品红法染色后，于光镜下观察组织学行为、用Image-ProPlusR软件测量BAP和BIC。
　　 结果：
　　 植入后6周，rhBMP2/7组达到了完全的骨愈合。组织学观察可以发现rhBMP2/7能早期促进成骨细胞的分化聚集，在植入后2、3周即能观察到成骨细胞规则排列在新骨周围。在BAP值上，在每个观察时间点，rhBMP2/7组均为最高，对照组均为最低，rhBMP2/7组显著高于rhBMP2，7和对照组(p<0.05)，同样rhBMP2、7组也高于对照组(p<0.05)。植入后2周，rhBMP2/7组的BIC增加明显，高于rhBMP2、7组(p<0.05)，rhBMP2、7组也高于对照组(p<0.05)。植入后3周，各rhBMP组高于对照组(p<0.05)，但各rhBMP组之间无统计学上的差别。植入后6周，各组的BIC值无统计学上的差别。
　　 结论：
　　 硬组织切片的结果进一步证实了Micro-CT的结果。rhBMP2、7同源二聚体在30ng/mm3的浓度下同对照组相比能诱导形成更多的新骨，rhBMP2/7异二聚体同rhBMP2、7同源二聚体相比，诱导形成了更多的新骨，并能早期促进骨种植体的结合。