解脲脲原体14种血清型荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

研究背景:
　　 解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，Uu）属于柔膜体纲，是一类介于细菌和病毒之间，没有细胞壁，目前能在人工培养基上生长繁殖的最小原核微生物。目前为止，已知与人类疾病有关的有14种血清型，最近14种血清型又根据各种标准被划分为两个生物群，即微小脲原体(U.parvum，UPA)包括血清型1，3，6，14;解脲脲原体(U.urealyticum，UUR)包括其余10种血清型。Uu虽然广泛存在于健康人群泌尿生殖道中，但同时它们还和很多疾病有关，如非淋球菌性尿道炎（Nongonococcal urethritis，NGU）、绒毛膜羊膜炎等。关于Uu的致病机制目前还不清楚。多年来人们一直在猜测某一群或血清型和特定疾病之间的相关性，但仍尚未有统一的意见，其主要原因是缺乏一种标准化、商品化的14种血清型检测方法。传统的以抗体为基础的分型方法由于操作繁琐，可重复性差一直未得到广泛应用。近年来分子生物学技术对Uu鉴定和分型的方法得到了快速发展，但由于Uu群内各血清型基因序列高度一致，目前为止还没有一种理想的方法检测Uu14种血清型，所以建立一种快速、精准的分型方法在研究Uu致病性和流行病学调查方面就显得尤为重要。本研究旨在建立Uu14种血清型分子生物学检测方法，为今后在血清型水平进一步研究Uu的致病性奠定方法学基础，并应用此方法对分离于健康人群生殖道的Uu进行分型，了解健康人群中Uu血清型的分布，为流行病学调查提供依据。
　　 方法:
　　 1.收集2012年3-9月在邵逸夫医院体检的女性宫颈分泌物标本220例，体检者均无泌尿生殖道炎症症状。
　　 2.将标本接种于液体选择性培养基，阳性培养液接再转种于A7固体培养基，观察典型菌落进一步确认。
　　 3.确认为Uu阳性的液体培养液制备DNA模板。
　　 4.通过对Uu14种血清型全基因组进行评估，设计各血清型特异的引物和探针，建立检测Uu14种血清型的荧光定量PCR法，用ATCC标准菌株验证其特异性和敏感性。
　　 5.参考文献对上述临床标本进行分群，然后应用已建立的荧光定量PCR方法进一步分型。
　　 6.统计分析。
　　 结果:
　　 1.成功建立了一套Uu14种血清型荧光定量PCR检测方法，检出限范围为22拷贝/微升（血清型1）到3200拷贝/微升（血清型5）。
　　 2.临床标本培养结果:220例临床标本液体培养共有108例阳性，经A7固体培养基培养确认后共有106例阳性标本。
　　 3.临床Uu阳性标本分群结果:106株Uu阳性标本中75株(70.8％)为UPA;29株(27.3％)为UUR;2株(1.9％)未能分群;未分到UPA和UUR混合阳性株。
　　 4.临床Uu阳性标本分型结果:单一血清型的占83.0％（血清型1占30.2％、血清型3占22.6％、血清型6占7.5％、血清型9占7.5％）、混合血清型的占11.3％、未能分血清型的占5.7％。
　　 结论:
　　 1.成功建立了一套完整的Uu14种血清型分子生物学检测方法，该方法特异性强、敏感度高而又切实可行，为今后在血清型水平进一步研究Uu的致病性奠定了方法学基础。
　　 2.浙江地区健康女性下生殖道Uu生物群以UPA为主。
　　 3.Uu血清型1、3、6、9为浙江地区健康女性下生殖道常见的寄居型。

目录

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致谢

摘要

英文缩写、术语表

1．引言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

4．讨论

参考文献

综述 解脲脲原体生物群和基因型分型研究进展

作者简历及在读期间取得的科研成果