产前细胞遗传学诊断质控物及其室间质评方法的研究

摘要

研究背景：
　　 实验诊断项目的质量控制已成为政府行为。我国卫生主管部门指出，实验室必须有规范的质量控制标准，所开展的实验诊断项目必须参加卫生主管部门组织的室间质评。我国自1982年成立卫生部临检中心后，先后开展了临床检验的室内质控和室间质评。中华人民共和国主席令（1994年10月27日第三十三号）公布的“产前诊断法规标准”以及国务院办公厅[国发办(1999)15号]转发卫生部“关于做好提高出生人口素质工作意见”的通知中强调指出:“各省、市产前诊断中心必须加强产前诊断的质量控制、严把质量关”。
　　 产前诊断的质量控制是许多学者致力于研究的重要课题。国外有较多的文献报道了产前诊断质量控制的重要性[1]，Sikkema-Raddatz B等[2]对产前细胞遗传学诊断的细胞培养及制片过程的影响因素作了深入的研究，提出了室内质量控制的方法;Fries N和Merz E等[3(.)4]提出了影像学产前诊断的质量控制方法;Pihlk等[5]认为必须加强产前筛查的质量控制;Weng BH等[6]对染色体核型分析的室间质评作了研究，认为各实验室对疑难、罕见的染色体病诊断，具有较高的误诊率，应开展染色体核型分析的室间质评;在2002～2004年期间，Bastien P等[7]对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重要的作用;为了调查各产前诊断实验室的分子遗传学诊断结果的准确性，Ramsden SC等[8]以15份不同的质评标本，在3年内，对最初参评的9个实验室、以及最后参评的27个实验室作了为期3年的室间质量评估，表明了开展产前快速诊断常见染色体数目异常的分子遗传学技术的室闻质量评估的重要性和必要性。
　　 质控物是开展室间质评的先决条件。虽然近年来也有越来越多的国外文献报道开展产前诊断质量控制的重要性，但其观点仅仅局限于严格实验操作的具体步骤的注意事项方面，即反映实验结果精密度的室内质控方面，并没有提出通过制备质控物、从而开展反映实验结果准确性的室间质评。开展室间质评的先决条件是具有可行的质控物。所以，研发质控细胞株，以开展产前细胞遗传学诊断的室间质评，具有重要的意义。
　　 本文拟以各种在产前诊断中发现的易于误诊的染色体异常淋巴细胞作为原代细胞，经EB病毒转染或转基因技术，建立具有“永久生存、无限扩增”性能的质控细胞株，从而将有限的易误诊病例细胞转变为无限量的、无限期的、可供多家实验室同时作室间质评的永生化质控细胞。达到开展室间质评，以实时监测和发现质量问题、及时整改，从而提高产前诊断质量。
　　 （本项目已于2011年11月9日被国家知识产权局授予国家发明专利，发表相关论文5篇，2012年5月6日与卫生部临检中心签定了进一步产业化研究的合作协议）
　　 目的：
　　 建立易于误诊的疑难、罕见染色体异常淋巴细胞株，并制备质控细胞株，为开展产前细胞遗传学诊断室间质评奠定基础;
　　 建立染色体异常核型图像库，并制成染色体异常核型质控图，用于开展产前细胞遗传学诊断的简易室间质评。
　　 方法：
　　 收集经相关实验室确诊的染色体异常核型的外周血或脐血，分离淋巴细胞，用EB病毒(EB virus，EBV)转染人类B淋巴细胞的建株方法，建立染色体异常核型质控淋巴细胞株，以每管为1ml、细胞浓度为105/ml的规格分装于冻存管，经-20℃2h，再置-70℃2h，然后冻存于-196℃的液氮中备用。1～3个月后，取出冻存管，每例相同核型的质控淋巴细胞株各取2管，其中1管直接置液氮罐中（加干冰），经48h途中转送后，再将冻存管置于37℃水浴，震摇融化，离心去上清液，以培养液洗涤、离心二次后，作常规细胞培养、染色体制备、拍摄染色体图像，以此验证质控细胞株直接用于室间质评的可行性;而另1管则立即置37℃水浴，震摇融化，离心去上清液，以培养液洗涤、离心二次后，再加新鲜培养液，培养24h后，更换新鲜培养液，以充液运输法、经10～30℃、48h途中转送后，再作常规细胞培养、染色体制备、拍摄染色体图像，制作染色体图像质控图，以E-mail发送到各被考核人员，在分析染色体图像后，以E-mail反馈分析结果。质控图的发放者统计、评估各被考核对象所反馈的染色体分析结果的误诊情况，然后将评估结果通知各被考核对象。以此验证以染色体异常核型质控图用于开展产前细胞遗传学诊断简易室间质评的可行性。
　　 结果：
　　 建成10例染色体异常核型质控细胞株，其中6例为易于误诊的疑难、罕见核型。质控细胞株经冻存、解融、换液、15～25℃48h再作细胞培养和染色体制备，所得到的核型图为46，X，t(Y;5)(q12;q21)、46，XY,15P+、46，XX，t(13;18)(q12;q21)、46，X，r(Xp)、46，X，t(Y;Y)、46，XX，t(9;20)(P13;p13)。其中被优选的每例3幅核型图对35位代表各自产前诊断实验室的被考核对象的简易室间质评结果表明，各自所反馈的相对应于上述核型图中6例染色体异常核型排序结果的完全正确率分别为81.8％、78.1％、86.7％、78.8％、78.1％、90.3％，完全错误率分别为15.2％、21.9％、10.0％、18.2％、21.9％、6.5％，总的完全正确率、部分正确率、部分错误率和完全错误率分别为82.2％、0.50％、1.60％和15.7％。
　　 结论：
　　 疑难、罕见染色体病的产前细胞遗传学诊断存在较高的误诊率，需研发质控物，建立室间质评网络，开展室间质评，以提高产前细胞遗传学诊断的准确性;
　　 建立易于误诊的疑难、罕见染色体异常质控细胞株，用于产前细胞遗传学诊断的室间质评，是较为理想的质控物制备方法。
　　 建立易于误诊的疑难、罕见染色体异常核型图像库，并制成染色体异常质控图，用于产前细胞遗传学诊断室间质评，是一种简便、易行的实用方法。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言

2 材料与方法

2．1 原代细胞

2．2 试剂及实验仪器

2．3 方法

3 结果

3．1 确立了染色体异常质控细胞株的制备方法

3．2 制备了10例染色体异帮质控细胞株

3．3 制作了6例疑难、罕见染色体异常质控图

3．4 提出了室间质评的评估标准

3．5 确立了室间质评的方法

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

作者简历及在学期间所取得的科研成果