稻水象甲体内细菌多样性及其和生殖的关系

摘要

共生细菌能在昆虫的生长、生殖、抵抗病原菌和有害物质等生物学过程中起重要的作用。稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel）在我国是一种重要外来入侵害虫，对水稻生产的潜在危害巨大。先期研究表明，Wolbachia是稻水象甲中的一种主要共生细菌，为宿主正常生殖所必需，但该象甲是否还存在其他共生细菌，对宿主生殖的作用如何，尚不清楚。本研究基于细菌16S rRNA序列的扩增和分析，对不同地理种群稻水象甲的肠道和卵巢中的细菌种类进行了鉴定，分析了细菌群落的多样性，并研究了主要细菌与其生殖的关系，探讨了影响宿主生殖的分子机制，具体结果如下:
　　对5个地理种群稻水象甲（美国德克萨斯州Beaumont、阿肯色州Colt、加利福尼亚州Biggs、河北唐海和浙江乐清）体内细菌种类研究发现，其肠道细菌隶属于α-、β-、γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲、鞘脂杆菌纲和放线菌纲，主要共生细菌有Pantoea和Wolbachia。除了Beaumont种群，其余4种群的细菌多样性均较低。在卵巢中仅发现3类细菌，即α-、γ-变形菌纲和芽孢杆菌纲，Wolbachia和Nardonella是主要的细菌。
　　定量检测了稻水象甲经抗生素处理后体内主要共生细菌的变化情况，并结合生殖表型的变化，评价了主要细菌在该象甲中的作用。结果表明，成虫经四环素处理后（不能正常生殖）体内Wolbachia含量比水处理的显著减低，而经庆大霉素处理后（仍能正常生殖）该细菌的变化不甚明显，这与预期相符。成虫分别经四环素、庆大霉素处理后，Nardonella均保持在较高水平。成虫经庆大霉素处理后，Rickettsia的含量显著降低。表明稻水象甲生殖与Nardonella和Rickettsia含量的变化无明显关系，两者不是该象甲生殖所必需的。该结果验证了Wolbachia在该象甲生殖过程中所起的重要作用。
　　对成虫分别进行四环素和庆大霉表处理，使其分别处于Wolbachia被去除和感染有这种细菌的状态，然后采用抑制性消减杂交技术(SSH)，构建了这两类成虫的消减杂交文库。对文库中的序列进行了克隆和GO分析，对其中部分基因在Wolbachia感染与不感染状态下的表达水平进行了定量检测。发现Wolbachia可影响该象甲多种基因的表达，包括与代谢过程、细胞过程、催化活性、生殖、免疫、死亡等相关的基因，其中3个基因的表达变化显著，即核槠体RNA反义转录蛋白(transcript antisense to ribosomal RNA protein1，TAR1)类似物、一种假设蛋白和保幼激素环氧化物水解酶类似蛋白5前体(juvenile hormoneepoxide hydrolase-like protein5 precursor)。
　　通过本研究，明确稻水象甲体内共生细菌的主要种类和多样性，以及主要共生细菌在该象甲生殖中的作用及其部分机制。研究结果丰富了我们对象甲类昆虫与共生细菌关系的认识，为今后开展此类昆虫中共生细菌演化、生殖机制、细菌与宿主的互作机制等方面的研究提供了重要信息。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫体内细菌群落的多样性

1．2 共生细菌对宿主昆虫生殖的调控及其机制——以Wolbachia为例

1．2．1 Wolbachia调控昆虫生殖的方式

1．2．2 Wolbachia调控宿主生殖的机制

1．3 稻水象甲体内细菌及其功能研究进展

1．4 本研究的内容、目的与意义

第二章 不同地理种群稻水象甲肠道和卵巢中细菌的多样性

2．1 材料和方法

2．1．1 供试虫源

2．1．2 主要实验仪器和试剂

2，1．3 稻水象甲肠道和卵巢16S rRNA文库的构建

2．1．4 测序

2．1．5 序列分析

2．1．6 细菌多样性分析

2．1．7 序列提交

2．2 结果

2．2．1 稻水象甲肠道细菌种类与多样性

2．2．2 不同地理种群稻水象甲卵巢细菌多样性

2．3 讨论

第三章 主要共生细菌与稻水象甲生殖的关系

3．1 材料和方法

3．1．1 供试虫源

3．1．2 抗生素处理及供试昆虫的准备

3．1．3 成虫中细菌含量测定

3．1．4 不同抗生素处理中后代卵粒中的细菌种类检测

3．1．5 数据处理

3．2 结果与讨论

3．2．1 不同抗生素处理共生细菌定量检测

3．2．2 稻水象甲卵巢和卵的细菌多样性

第四章 稻水象甲消减杂交文库构楚和筛选后的定量检测

4．1 材料与方法

4．1．1 供试虫源

4．1．2 实验处理和消减杂交文库构建

4．1．3 消减文库的克隆与分析

4．1．4 同源序列搜索和序列注释

4．1．5 SSH筛选生殖相关基因后的定量检测

4．1．6 数据分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 消减杂交文库构建结果及分析

4．2．2 相关基因表达水平的定量检测

4．2．3 关于研究方法

总结

参考文献