EGCG通过抑制溶酶体途径增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性

摘要

[研究目的]
　　医学上一般使用化疗和放疗医治子宫颈癌等恶性肿瘤。但是肿瘤化疗和放疗都有较大的毒副作用，所以利用毒性低的天然植物化学物作为肿瘤的预防和治疗一直是人们研究的方向。EGCG（epigallocathechin-3-gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯）是茶多酚的主要成分。已有的体外研究发现EGCG能够诱导肿瘤细胞发生凋亡，具有潜在的肿瘤预防和治疗的作用。我们实验室先前的研究发现EGCG在无血清培养条件下可以通过抑制细胞自噬，降低肿瘤细胞的生长活性。我们使用子宫颈癌HeLa细胞在正常培养条件下发现EGCG可以抑制自噬，还发现EGCG使溶酶体膜通透性改变并发生渗漏。溶酶体失活使自噬过程无法完成，导致细胞内自噬体显著增加囤积。有文献指出抑制自噬能增加传统化疗药物顺铂诱导的凋亡，是因为自噬使癌细胞对顺铂的耐药性增强。因此我们使用EGCG结合传统化疗药物顺铂，以便观察EGCG对顺铂诱发子宫颈癌HeLa细胞死亡的增敏效果。EGCG通过抑制自噬，使顺铂更有效的发挥药效。与EGCG同时作用降低了顺铂的所需给药浓度却显著地增加了HeLa细胞对顺铂的敏感性。
　　[研究方法]
　　1.细胞培养:细胞分别在完全培养液中培养，随后加入EGCG、加或不加顺铂处理不同时间;
　　2.Hoechst-PI双染检测细胞存活率:hoechst标记总细胞，PI标记死细胞，利用软件Image J计数细胞;
　　3.Western blotting实验:提取细胞总蛋白，检测不同蛋白在细胞内的表达;
　　4.细胞染色:吖啶橙染色，油红O染色，Lyso-Tracker Red探针标记;
　　[研究结果]
　　1.宫颈癌细胞的存活率随着EGCG剂量的增加逐渐降低。EGCG抑制自噬的效果呈剂量-效应关系。
　　2.EGCG与顺铂联合作用的宫颈癌细胞存活率存在剂量和时间-效应关系。
　　3.EGCG与顺铂联合作用造成大量的自噬小体囤积在宫颈癌细胞内，并造成自噬受阻。
　　4.Lysotracker-red染色的结果说明EGCG对溶酶体功能造成影响。但在使用Westernblotting检测溶酶体主要膜蛋白的结果却显示溶酶体数目并没有减少。
　　5.从Lysotracker-red和AO染色的实验结果观察，溶酶体的pH值上升了，而胞浆却有酸化的迹象。
　　[研究结论]
　　1.EGCG与顺铂联合作用后肿瘤细胞内出现大量的自噬体堆积，自噬体不能有效的被清除;这个结果反映了自噬的下游被阻断，造成自噬被抑制。
　　2.研究发现自噬体的清除受到阻碍主要是因为EGCG能对肿瘤细胞溶酶体造成损伤。EGCG的作用机制主要是通过改变溶酶体的通透性，使溶酶体发生渗漏，胞浆酸化，溶酶体内pH发生改变导致其内的水解酶等失活，进而抑制自噬的最后阶段。
　　3.EGCG与顺铂联合作用，可增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，其机理是由于EGCG造成的溶酶体膜损伤可以直接造成细胞死亡。而顺铂使肿瘤细胞内的自噬机制被激活发挥保护作用;但由于溶酶体丧失了降解功能，自噬被抑制造成耐药失效，进而使顺铂的药效增强。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

1．引言

1．1 茶多酚及其抗肿瘤作用研究现状

1．2 溶酶体与自噬相关的调控机制和肿瘤的关系

2 材料和方法

2．1 细胞系

2．2 细胞培养及处理试剂

2．3 Hoechst-PI双染检测细胞存活率相关试剂及方法

2．4 Western blotting实验检测相关试剂及方法

2．5 细胞染色相关试剂及方法

2．6 仪器和设备

3 实验结果

3．1 EGCG对HeLa细胞活性、凋亡和自噬的影响

3．2 EGCG和顺铂联合使用对HeLa细胞活性的影响

3．3 EGCG影响自噬的机制

4 讨论

5 结论

参考文献

综述自噬在肿瘤化疗期间的角色

作者简历及在读期间所取得的科研成果