醌氧化还原酶-1的单核苷酸基因多态性与中国人冠心病的关联研究

摘要

背景:
　　冠心病（Coronary heart disease，CHD）是严重危害人体健康、影响生活质量的常见病。遗传流行病学研究显示冠心病的发病有遗传因素作用，且与机体内氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）的活化和内环境不稳定密切相关。
　　转录因子Nrf2/ARE（NF-E2-related factor2/antioxidant response element）调控多个解毒基因的表达，如过氧化氢酶，过氧化物歧化酶，UDP葡糖醛酸基转移酶，谷氨酰半胱氨酸合成酶，醌氧化还原酶-1(NADP(H): quinine oxidoreductasel，NQO1)，谷胱甘肽S-转移酶，谷胱甘肽过氧化物酶-1和血红素氧合酶-1。这些酶中的NQO1为体内一种重要的Ⅱ相反应酶，通过去电子还原反应参与机体内外源物质代谢过程，是苯类物质代谢的关键酶，苯代谢产物苯醌具有强烈的致畸变作用，NQO1可以将其转化为毒性较低的氢醌而清除，是公认的解毒酶和防癌酶。
　　NQO1基因定位于16p22，基因全长20kb，其cDNA609位点上存在着C/T间单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。此位点多态性导致其编码蛋白质上第187位上脯氨酸/丝氨酸(Pro187Ser)的改变，导致其酶活性的减低，NQO1以NADP(H)为受体，可将NADH或NADP(H)的电子传递给醌类，发生双电子还原反应，生成低毒的氢醌类化合物，避免了对细胞的损伤，降低了醌类化合物的致癌危险性。有研究报道NQO1基因突变型蛋白产物在细胞中不稳定，其半衰期只有2小时，而野生型蛋白半衰期为18小时，突变型蛋白通过细胞内蛋白水解酶途径快速降解，而野生型蛋白不受此途径影响，基因的多态性影响NQO1酶的功能。纯合野生型CC具有完全的NQO1酶活性，杂合基因型CT的酶活力较CC明显降低，纯合突变基因型TT的酶活性则完全丧失。因突变的NQO1蛋白会被泛素蛋白酶系统迅速降解掉，携带有纯合子变异的个体检测不到酶活力。由于NQO1基因具有遗传多态现象，而且不同的基因型具有不同的生理功能，近年来，研究NQO1基因多态性与冠心病的发生发展已成为一个新的重要课题。
　　有研究表明NQO1基因型与冠心病的发生密切相关。基于NQO1基因多态性可通过影响机体内外源物质代谢过程，从而可能参与动脉粥样硬化的进程，而且不同的种族和地域NQO1基因多态性可能存在一定的差异，目前国内尚无有关NQO1基因多态性与冠心病相关性研究的报道，因此对中国汉族人该基因多态性和冠心病的探讨是可行的和值得的。
　　目的:
　　本研究通过检测浙江地区中国汉族人NQO1基因多态性频率，以探讨NQO1基因多态性与冠心病发生发展的关系。
　　方法:
　　1研究对象
　　冠心病组:
　　冠心病患者296例，其中男性217例，女性79例，平均年龄62.81±9.80岁。均选自.2012年1月至2013年6月心内科住院病人，符合世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，所有患者经冠状动脉造影证实其一主要血管存在≥50％狭窄。
　　对照组:对照组286例，其中男性208例，女性78例，平均年龄61.56±10.44岁。选自同期住院病人，所有入选者经心电图，运动平板，心肌酶谱及冠脉造影等一系列检查后排除冠心病诊断。
　　本研究人群均为中国浙江地区汉族人，个体之间无血缘关系。
　　2冠心病的诊断
　　冠状动脉造影时，分别对右冠状动脉、左冠状动脉前降支、左旋支和左主干狭窄病变程度进行评价。各主要分支存在≥50％狭窄定义为有意义病变，诊断为冠心病。
　　3冠心病危险因子调查
　　设计冠状动脉粥样硬化登记调查表，详细记录每一患者的临床表现，辅助检查，化验检查结果，危险因素及冠心病家族史。
　　冠心病经典危险因子按下述标准定义:
　　3.1高血压采用1999年世界卫生组织和国际高血压学会(WHO/ISH)的标准定义和诊断。
　　3.2糖尿病符合1997年美国糖尿病学会（ADA）糖尿病诊断标准。
　　3.3吸烟指目前吸烟和既往吸烟已经戒烟者。
　　4基因组DNA抽提和NQO1基因多态性检测
　　4.1白细胞基因组DNA抽提:以试剂盒法提取外周血白细胞DNA。
　　4.2 NQO1基因多态性检测:参考采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR—RFLP)方法进行分析。
　　上海生工引物合成:
　　正义链5'-CCTCTCTGTGCTTTCTGTATCC-3';
　　反义链5'-GATGGACTYGCCCAAGTGATG-3'。
　　反应使用MJ PTC200型PCR扩增仪，
　　PCR反应体系
　　Template DNA1ul
　　10×Tag Buffer with KCL2.5ul
　　25 mM MgCl21.5ul
　　dNTP Mix,2 mM each2.5ul
　　Forward primer1ul
　　Reverse primer1uL
　　Thermo Taq DNA Polymerase,5u/ul0.1ul
　　DdH2O15.4ul
　　Total Volume25ul
　　体系25μl含有大约100ng基因组DNA，10pmol每种引物，0.5 mmol/L dNTPs，10×PCR缓冲液
　　扩增条件为:
　　在PCR热循环仪上扩增，94℃预变性5分钟，然后94℃变性40秒，63℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共进行35个循环，最后在72℃延伸10分钟。取10ulPCR产物在31ul体系中用HINfl内切酶酶切后进行含2％琼脂糖电泳，经70伏特20分钟，在紫外光下观察，摄影并确定结果。NQO1C609T基因野生型产生214 bp和84 bp2个条带，纯合子变异PCR产物产生149 bp、65 bp和84 bp3个条带，杂合子变异产生214bp、149 bp、65 bp和84 bp4个条带。
　　5统计分析
　　资料输入数据库，应用SPSS18.0软件包作统计学处理。连续变量以均数±标示准差((X)±S)表示，计数资料以频数和构成比表示。运用Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。多组均数间比较用方差分析，两组均数间比较用t检验，非正态分布和方差不齐的资料采用非参数统计。检验水准a=0.05，所有结果在P＜0.05时视为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1研究对象的Hardy-Weinberg平衡
　　中国浙江汉族研究对象符合Hardy-Weinberg平衡，对照组和冠心病组x2值分别为0.045和0.705，P均＞0.05。
　　2研究对象的一般临床资料比较
　　冠心病组与对照组两组间平均年龄，糖尿病，高血压及吸烟比例比较没有显著差异(P＞0.05)，且两组间舒张压、BMI、TC及TG数值无显著差异(P＞0.05)。但冠心病组男性比率较对照组明显增加(P＜0.05)，收缩压及LDL-C水平明显增加(P＜0.05)而HDL-C水平显著降低(P＜0.01)。
　　3研究对象的NQO1基因多态性的比较
　　在浙江地区汉族人群冠心病组NQO1-C/C、NQO1-C/T、NQO1-T/T基因型频率分别为30.1％，47.3％，22。6％％。等位基因C与T的频率分布为53.7％％，46.3％。对照组NQO1-C/C、NQO1-C/T、NQO1-T/T基因型频率分别为33.5％，48.2％，18.3％。等位基因C与T的频率分布为57.6％，42.4％。
　　冠心病组与对照组相比无论是NQO1基因型分布还是等位基因的频率均无明显差异(P＞0.05)。
　　4冠心病组各基因型间冠心病危险因子的比较
　　NQO1基因型三组间性别比例，糖尿病、高血压及吸烟比例比较没有明显差异(P＞0.05)，且三组间平均年龄、收缩压、舒张压及BMI数值无明显差异(P＞0.05)。但NQO1基因型三组间的TG数值有明显差异(P＜0.05)，三组间的LDL-C、HDL-C及TC水平比较有显著差异(P＜0.01)。进一步行组间的两两比较。具体表现为纯合野生基因型NQO1-C/C组的TG数值比杂合基因型NQO1-C/T组明显升高(P＜0.05)，纯合突变基因型NQO1-T/T组的HDL-C水平显著高于杂合基因型NQO1-C/T组(P＜0.01)。而纯合突变基因型NQO1-T/T组和杂合基因型NQO1-C/T组的LDL-C及TC水平均显著高于纯合野生基因型NQO1-C/C组(P＜0.01)。
　　结论:
　　1.浙江地区汉族人群存在NQO1基因多态性，为在我国汉族进行NQO1基因多态性与疾病的关联研究提供了该基因分布的参考数据。
　　2.冠心病组比对照组具有较高的男性比例，较高的收缩压及LDL-C水平，但更低的HDL-C数值。
　　3.浙江地区汉族人群NQO1的C609T单核苷酸基因型与冠心病的发生不相关。
　　4.NQO1的C609T单核苷酸基因型可能影响血脂代谢过程。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

引言

资料与方法

1 研究对象

2 冠心病的诊断

3 冠心病危险因子调查

4 DNA提取试剂配置

5 DNA提取步骤

6 NQO1基因多态性的检测

7 统计分析

结果

1．研究对象的Hardy-Weinberg平衡检验

2．研究对象的一般临床资料

3．NQO1基因多态性的分布

4．冠心病组各基因型间冠心病危险因子的比较

讨论

结论

参考文献

冠心病的遗传病因研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果