超分子自组装纳米材料作为免疫治疗和小分子药物的载体用于抗肿瘤研究

摘要

化学药物治疗仍是治疗恶性肿瘤必不可少的治疗方法。但是由于药物水溶性，无靶向性，对其他器官的毒性以及药物的耐药问题，限制了其临床应用。随着新型超分子自组装纳米材料在现代医药学的发展，其作为抗癌药物载体得到了广泛地应用。通过超分子自组装纳米材料的介导作用，可以大大改善药物的水溶性，提高药物的生物利用度，实现对载药量和药物释放速度的可控性。为克服化学药物的肿瘤耐药性问题，联合应用其他方法进行治疗，比如分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗等，以产生协同增效作用，将取得较好的治疗效果。
　　本论文用羟丙基环糊精(hy-CyD)偶联低分子量的聚乙烯亚胺(PEIMW=600)制备了阳离子聚合物PEI-hy-CyD(HPC);研究了阳离子聚合物PEI-β-hy-CyD(β-HPC)携带跨模型金黄色葡萄球菌肠毒素A超抗原基因TM-SEA(TSA)与吉非替尼(GFT)在非小细胞肺癌治疗中的作用;研究了PEI-γ-hy-CyD(γ-HPC)与金刚烷-阿霉素(Ada-Dox)形成的超分子纳米材料γ-HPC/Ada-Dox(γ-PAD)的抗肿瘤活性，证实了γ-PAD可同时携带Dox和siRNA进入细胞并发挥作用。
　　本论文研究的主要内容及结论如下:
　　第一部分阳离子聚合物β-HPC与GFT通过亲疏水性作用形成超分子纳米前药β-HPC/GFT，该前药表面带有正电荷，可与TSA质粒通过静电相互作用形成β-HPC/GFT/TSA复合物。体外实验表明该药物基因输送体系可在Lewis小鼠肺癌细胞中(LLC)表达出SEA蛋白并锚定在细胞膜上，且由于GFT作用，该体系具有一定的抗肿瘤活性。体内实验结果表明，β-HPC/TSA可显著提高小鼠的免疫功能，调节CD4/CD8处于1.5-2.5范围内，上调TNF-α和IFN-γ分泌量，并协同注射β-HPC/GFT，抑制Lewis小鼠肺癌(LLC)肿瘤效果明显优于GFT、TSA或β-HPC/GFT/TSA。
　　第二部分将阳离子聚合物γ-HPC作为主体，金刚烷偶合阿霉素Ada-Dox作为客体，主客体自组装形成超分子纳米材料γ-PAD，协同运载化疗药物Dox和siRNA。γ-PAD能有效结合siRNA，形成粒径在200nm左右的微球。体外细胞转染实验表明γ-hy-PAD能携带药物和基因同时进入HEK293细胞中，MTT、细胞划痕以及H/E染色实验表明γ-hy-PAD具有一定的抗肿瘤活性，GFP绿色荧光蛋白的沉默实验表明，γ-PAD可携带siGFP进入细胞并沉默绿色荧光蛋白基因的表达。

目录

声明

基金资助项目

摘要

中英文对照表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 超分子基因药物递送系统

1．2．1 CD为主体的运载药物超分子纳米材料

1．2．2 CD为主体的运载基因超分子纳米材料

1．3 肿瘤的免疫基因治疗

1．3．1 肿瘤基因治疗

1．3．2 抗体治疗

1．3．3 肿瘤疫苗治疗

1．3．4 肿瘤免疫过继细胞治疗

1．3．5 肿瘤细胞因子治疗

1．4 肿瘤的免疫治疗和化学治疗的联合

1．5 本课题的提出

参考文献

第二章 超分子自组装材料介导的吉非替尼和超抗原引起的免疫活化联合治疗非小细胞肺癌

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 材料和试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 细胞株

2．2．4 实验动物

2．3 实验方法

2．3．1 阳离子材料β-HPC的合成

2．3．2 超分子自组装纳米材料β-hy-PC／Gefitinib(β-HPC／GFT)的合成

2．3．3 超分子自组装纳米材料的化学表征

2．3．4 超分子自组装纳米材料的物理学表征

2．3．5 超分子自组装纳米材料的细胞毒性实验

2．3．6 体外转染实验

2．3．7 激光共聚焦显微镜观察

2．3．8 SEA蛋白表达量Western Blot测定

2．3．9 LLC肺癌皮下肿瘤模型的建立

2．3．10 最佳免疫条件的选择

2．3．11 小鼠肺癌模型的治疗

2．3．12 18F-FDG micriPET显像技术

2．3．13 小鼠体内免疫指标的测定

2．3．14 肿瘤组织H／E染色

2．3．15 肿瘤组织TUNEL染色

2．3．16 统计学分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 β-HPC-与β-HPC／GFT的合成

2．4．2 纳米材料的化学表征

2．4．3 扫描电子显微镜观察

2．4．4 粒径与电势

2．4．5 琼脂糖凝胶电泳

2．4．6 药物释放动力学

2．4．7 MTT细胞毒性实验

2．4．8 体外转染实验

2．4．9 体外表达的激光共聚焦检测

2．4．10 Western Blot测定SEA蛋白表达量

2．3．11 免疫条件的选择

2．3．12 小鼠肺癌模型的治疗

2．3．13 18F-FDG micriPET显像技术

2．3．14 离体肿瘤组织中TSA蛋白含量

2．3．15 小鼠体内免疫指标的测定

2．3．16 肿瘤切片

2．5 本章小结

参考文献

第三章 主客体组装的金刚烷甲酸-阿霉素／聚阳离子材料及体外抗肿瘤活性的研究

3．1 前言

3．2 材料与仪器

3．2．1 材料和试剂

3．2．2 细胞及工作溶液

3．2．3 仪器设备

3．3 实验方法

3．3．1 材料的合成

3．3．2 材料的化学表征

3．3．3 粒径与zeta电位测定(Particle size and Zeta potential)

3．3．4 凝胶电泳阻滞实验

3．3．5 细胞毒性实验

3．3．6 细胞迁移实验

3．3．7 H／E染色实验

3．3．8 体外细胞转染实验

3．3．9 细胞吞噬实验

3．3．10 GFP沉默实验

3．3．11 统计学分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 材料的合成

3．4．2 材料的表征

3．4．3 粒径和电势测定

3．4．4 凝胶电泳阻滞实验

3．4．5 细胞毒性实验

3．4．6 细胞迁移实验

3．4．7 H／E染色结果

3．4．8 体外细胞转染

3．4．9 体外细胞吞噬实验

3．4．10 GFP的沉默实验

3．5 本章小结

参考文献

全文总结、创新点及未来的研究方向

攻读硕士学位期间主要研究成果

致谢