奥奈达希瓦氏菌中氧化胁迫的调控：OxyR和OhrR调节子在应答过程中的交叉作用

摘要

在环境中，微生物会遇到来自物理和化学等多方面的各种胁迫因素。活性氧(ROS)可以在细胞内大量产生，且大部分是胞内正常有氧生理代谢的副产物，因此，对于有氧环境中的细胞来说，ROS引起的氧胁迫是无法避免的。ROS包括多种多样的化学活性分子，例如自由基，氧化物及过氧化物等，其对细胞的毒性表现为对DNA、RNA、蛋白质和脂类的损伤，进而导致突变概率的增加和细胞死亡。细菌中，有大量的ROS清除酶以及修复和去除毒性的系统，它们通过抑制胞内ROS的浓度来阻止细胞损伤。氧化胁迫应答是使ROS产生与细胞应答ROS的能力之间保持平衡的一种细胞机制，对ROS的应答包括检测其存在、去除毒性和修复损伤等。氧化应答反应主要包括三种转录调控因子，即SoxRS、OxyR(或PerR)和OhrR，它们能够直接感应特定的ROS水平，通过自身氧化，提高相关消除底物毒性基因的表达。
　　奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis以其非凡的呼吸能力为人所知，存在于易于形成ROS的多层次氧化还原环境中。通过与已知的模型序列比对，我们发现基因编码的OxyR和OhrR的同源蛋白，两种分别特异性应答过氧化氢(H2O2)和有机过氧化物(OP)的ROS调节子。这些同源蛋白能够为机体提供保护，使其免于被ROS伤害。最近发表了S.oneidensis中OxyR的研究成果，它在调控由H2O2诱导的ROS胁迫过程中，既是抑制子，又能作为激活子发挥作用。在本研究中，我们首次阐述了S.oneidensis中应答由有机过氧化物诱导引起的ROS胁迫的分子机理。我们发现，S.oneidensis中有一个具有两个保守特征的OPs胁迫调节子OhrR。在调控过程中，OhrR的感应和应答残基并非同等重要，另外，除了ohr基因外（编码主要的OP清除蛋白），它还直接调节，O1563基因的转录。重要的是，我们有证据显示S.oneidensis中OxyR和OhrR调节子在发挥功能作用过程中有交叉，OxyR和OhrR系统都能够感应和应答H2O2及有机过氧化物。

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摘要

缩略语

1 绪论

1．1 ROS的产生及来源

1．2 ROS对徼生物的损伤

1．2．1 DNA损伤

1．2．2 RNA损伤

1．2．3 蛋白损伤

1．2．4 其它损伤

1．3 徼生物应答ROS的机制

1．3．1 可诱导的调节子

1．3．2 细胞防御机制

1．4 本实验的研究背景

1．4．1 S．oneidensis的特征

1．4．2 S．oneidensis ROS产生及应答研究

2 S．oneidensis对ROS胁迫的应答及调控

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株、质粒和培养条件

2．1．2 S．oneidensis对tBOOH应答反应中的生理特征

2．1．3 突变菌株和回补质粒的构建

2．1．4 定点突变

2．1．5 酶学分析

2．1．6 基因表达分析

2．1．7 细菌单杂交分析

2．1．8 OhrRso蛋白的表达和纯化

2．1．9 DTNB分析

2．1．10 其它分析

2．2 实验结果与分析

2．2．1 S．oneidensis对OPs应答反应的特性

2．2．2 ohr基因的诱导表达及其功能

2．2．3 S．oneidensis中的OhrR是应答OPs胁迫的调控蛋白

2．2．4 在S．oneidensis中ohr基因受到OhrR的直接调控

2．2．5 S．oneidensis OhrR的操纵子序列与已知的OhrRs共同基序相似

2．2．6 基因SO1563是S．oneidensis OhrRso调节子的成员

2．2．7 AhpCF能够清除OPs

2．2．8 OxyRso对OPs胁迫有响应

3 总结讨论

3．1 研究创新点

3．2 研究结果总结

3．3 研究存在的不足

参考文献