钩端螺旋体LA2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶活性的研究

摘要

目的:确定问号钩端螺旋体（简称钩体）LA2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶活性(PAF-AH)、感染细胞时表达与分泌情况，以及诱导金地鼠内脏出血的作用。
　　方法:采用PCR扩增问号钩体黄疸出血群赖型赖株无信号肽LA2144基因并构建其原核表达系统，采用Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rLep-PAF-AH。采用分光光度法检测rLep-PAF-AH水解PAF底物的活性、水解效率及Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和Western Blot法分别检测问号钩体赖株感染人脐静脉内皮细胞HUVEC、人单核细胞THP-1和小鼠巨噬细胞J774A.1后，LA2144基因mRNA(Lep-PAF-AH-mRNA)水平变化及产物外分泌情况。金地鼠尾静脉两次注射100μg无LPS的rLep-PAF-AH后观察肺、肝、肾组织中出血情况。
　　结果:所构建的问号钩体赖株LA2144基因原核表达系统在IPTG诱导下能高效表达rLep-PAF-AH，Ni-NTA亲和层析法提纯的rLep-PAF-AH经SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带。5μg rLep-PAF-AH对底物的水解效率为26.6 U/L，其Km和Kcat值分别为82.79μmol/L和0.24 S-1。问号钩体赖株与HUVEC、THP-1和J774A.1细胞共培养1或2 h，Lep-PAF-AH-mRNA水平显著升高(p＜0.05)。问号钩体赖株与上述细胞共培养2～12h，培养物上清中检出大量Lep-PAF-AH，但其EMJH培养物上清中未检出Lep-PAF-AH。rLep-PAF-AH注射金地鼠出现肺出血，但肝、肾组织中无明显出血现象。
　　结论:LA2144基因产物具有较强PAF-AH活性，感染细胞时表达上调并外分泌、诱导金地鼠肺出血，故是问号钩体感染时引起宿主出血的重要毒力因子。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言

2 问号钩体LA2144基因原核表达系统构建及抗血清制

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

3 rLep-PAF-AH的PAF-AH酶活性测定

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

4 问号钩体感染细胞前后Lep-PAF-AH-mRNA水平变化

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

5 问号钩体感染细胞前后Lep-PAF-AH表达和分泌检测

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果

6 Lep-PAF-AH在宿主内脏组织出血中的作用研究

6．1 材料

6．2 方法

6．3 结果

7 讨论

8 结论

参考文献

综述 血小板活化因子乙酰水解酶的研究进展

作者简介及在读期间所取得的科研成果