利用多重gRNA介导的CRISPR/Cas技术对拟南芥IAA2和小立碗藓LrgB基因编辑的研究

摘要

IAA2是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员，这类基因在植物生长发育中起着非常重要的作用，但是目前该基因的失去功能型突变体还没有报道，阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。小立碗藓由于配子体占主导地位，容易培养，容易发生同源重组，是一种新型的模式植物。拟南芥的LrgB基因与光呼吸和细胞死亡调控有关，小立碗藓中有两个LrgB同源基因，分别为PpLrgB1和PpLrgB2，但是具体功能还不清楚。CRISPR(clustered regulatoryinterspersed short palindromic repeat-associated endonuclease)是细菌和古菌抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas已被改造成一种高效的基因组定点编辑技术。与锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活样效应器核酸酶(TALEN)相比，CRISPR/Cas9系统具有操作简单、突变率高、费用节省等优点，在各种模式生物和农作物中广泛使用。在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中，一个gRNA只能靶向基因的一个位点，有时基因敲除的效率并不高。本文中，为了提高敲除效率，我们在Golden-Gate克隆技术的基础上，通过两轮PCR反应，将每三个gRNA串联到同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。与单个gRNA相比，多重gRNA的基因敲除效率高、种系突变多;与其他构建多重gRNA载体的方法相比，我们的方法具有快速、高效等优点。实验中得到了7个突变体，包括碱基插入突变和缺失突变。并且初步发现了这些突变体的表型，比如对NAA的敏感性较强，叶柄较长，根的向地性增强。这7种突变体及表型为进一步探究IAA2功能和作用机制提供了良好的材料。我们还得到了小立碗藓PpLrgB1和PpLrgB2的基因敲除克隆，突变体尚需进一步鉴定。
　　论文在下列两个方面进行了深入讨论:
　　1.两轮PCR法与两轮克隆法串联gRNA的比较
　　前者只需要转化一次，使用1管感受态细胞，而且只需要一种Ⅱs型核酸内切酶;而后者需要转化两次，使用4管感受态细胞，需要两种Ⅱs型核酸内切酶。因此，两轮PCR法更加节约时间和成本，具有快速、高效等优点。
　　2.突变体检测方法的比较
　　常用的突变检测的方法是T7核酸内切酶酶切法，但是该酶活性易受温度，酶量和反应时间的影响，而且有时候会出现假阳性和假阴性，我们利用T7核酸内切酶酶切法联和PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)法检测突变，结果发现PAGE方法的灵敏度和准确度更高，成本低，而且可以根据条带的个数预测突变形式的个数。但是PAGE制胶过程较为复杂，没有T7酶切后琼脂糖凝胶电泳更加方便。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 CRISPR／Cas系统

1．1．1 CRISPR／Cas系统的研究历史

1．1．2 CRISPR／Cas系统的基本结构和类型

1．1．3 CRISPR／Cas系统的作用机制

1．1．4 作为基因组编辑技术CRISPR／Cas系统与ZFN，TELEN的比较

1．1．5 CRISPR系统的应用与发展

1．2 IAA2研究背景

1．3 小立碗藓的研究进展

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 原始载体

2．3 入门载体的构建

2．3．1 gRNA靶位点的选择

2．3．2 单个gRNA表达框的扩增

2．3．3 三个gRNA表达框的扩增和串联

2．3．4 转化及阳性克隆鉴定

2．4 目的载体的构建

2．5 表达载体的构建

2．6 转基因、筛选及种子萌发

2．6．1 拟南芥的培养

2．6．2 电转化

2．6．3 转基因

2．6．4 筛选

2．6．5 种子萌发

2．7 数据收集

2．7．1 DNA水平的数据收集

2．7．2 目的基因的扩增

2．7．3 突变体的检测

2．8 小立碗藓原丝体的培养

2．9 小立碗藓原生质体的制备

2．10 PEG介导的转化

第三章 实验结果

3．1 序列查找与靶位点设计

3．2 两轮PCR法串联多个gRNA表达框的优点

3．3 拟南芥IAA2 T0代突变的鉴定

3．4 拟南芥IAA2 T1代突变的鉴定

3．5 IAA2突变体测序结果及突交形式

3．6 表型观察与分析

3．7 PEG介导的小立碗藓原生质体转基因

第四章 讨论

参考文献

致谢

附录