长链非编码RNA H19通过调控S-腺苷同型半胱氨酸水解酶影响DNA甲基化

摘要

DNA甲基化已被证实在哺乳动物的发育和生理病理等诸多方面具有重要作用。本研究结果显示长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)H19结合并抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl homoeysteine hydrolase，SAHH)，后者是真核细胞中唯一能水解S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine，SAH)的酶。而S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)具有抑制S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)依赖的甲基转移酶功能。此类甲基转移酶能够甲基化一系列细胞内成分，包括核酸，蛋白，脂质和神经介质等。而在人体细胞中SAHH功能障碍可引起包括肿瘤，神经系统，心血管系统及肌肉病变在内的多种疾病。目前为止SAHH的调控机制尚不清楚。本研究阐述了长链非编码RNA H19抑制SAHH功能的分子机制，揭示了敲低H19可活化SAHH，进而通过DNMT3B使Igf2/H19/Nctc1基因座区域内编码长链非编码RNA Nctc1的基因的甲基化水平上升。全基因组水平的甲基化测序结果提示多个基因座的甲基化水平发生改变，且这些改变与H19调控SAHH影响甲基转移酶的假说相符。本研究发现长链非编码RNA H19在调控DNA甲基化动态变化中的作用机制，且这一调控机制可能在其它细胞内成分的甲基化过程中亦发挥作用，提示H19/SAHH调控轴可能成为多种疾病治疗的潜在靶点。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语及中英文对照

1 引言

2 材料与方法

2．1 主要试剂材料

2．2 主要仪器

2．3 细胞培养、分化、转染

2．4 H19荧光原位杂交

2．5 SAHH免疫荧光染色(8孔板)

2．6 蛋白免疫印迹(Western-blot)分析

2．7 RNA提取

2．8 cDNA合成

2．9 定量实时定量荧光PCR(Quantitative Real time-qPCR)

2．10 DNA提取

2．11 质粒构建(pH19-S1，pH19，pS1)

2．12 亲和纯化含H19的核糖核蛋白复合体以及蛋白鉴定

2．13 RIP+蛋白复合体免疫共沉淀 Protein complex immunoprecipitation(Co-IP)

2．14 甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

2．15 细胞内SAHH活性测定

2．16 染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)

2．17 全基因组甲基化测序

2．18 RNA-Seq及数据分析

2．19 凝胶电泳迁移率(Electrophoretic mobility shift analysis，EMSA)

2．20 体外rSAHH活性测定(In vitro rSAHH activity assays)

2．21 统计方法

3 技术路线

3．1 IncRNA H19与SAHH的相互作用

3．2 H19／SAHH／DNMT3B信号通路影响甲基化

4 结果

4．1 含H19的核糖核蛋白复合体内检测到SAHH

4．2 敲低H19上调SAHH的活性和DNMT3B介导的CME甲基化

4．3 CME甲基化升高可促进Nctc1的转录

4．4 SAHH介导H19依赖的CME甲基化

4．5 H19富含U的区域能与SAHH结合并抑制其水解活性

4．6 H19依赖的SAHH活性抑制引起全基因组水平的甲基化水平改变

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 长链非编码RNA在肿瘤中的作用机制研究进展及相关数据库介绍

作者简历及在学习期间所取得的科研成果