褪黑素在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中抗坏死性凋亡和抗神经炎症的机制研究

摘要

背景:
　　蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage，SAH)是一种高死亡率、高致残率的神经外科急症。动脉瘤性蛛网膜下腔出血是SAH最常见的类型，约占全部病例的85％。在过去很长的一段时间里，迟发性脑血管痉挛一直被认为是引起SAH患者预后不良的主要原因，然而在近20年的研究中，该研究方向并没有取得突破性进展，越来越多的证据表明SAH后除迟发性脑血管痉挛外，还存在其他重要的机制造成SAH患者预后不良。近年来，领域内的权威专家提出了早期脑损伤(EarlyBrain Injury，EBI)概念，即从SAH开始至72小时这一时间窗之内的脑损伤。EBI是一个非常复杂的病理生理过程，所涉及的分子机制十分复杂，包括炎症因子的释放、氧化应激的产生、谷氨酸的毒性作用、脂质过氧化、钙离子通道的开放、细胞凋亡或坏死等。截止目前，大量动物实验已经证实，神经细胞死亡和神经炎症反应是EBI的两大主要损伤机制。
　　褪黑素是一种由松果体分泌的神经内分泌激素，易渗透血脑屏障(Blood BrainBarrier，BBB)，具有良好的生物耐受性。近年来，褪黑素逐渐被证明可以通过减少氧化应激，抑制炎症反应，激活自噬和抑制凋亡等多种机制在SAH疾病中发挥神经保护作用。然而，这其中涉及的具体机制仍有待进一步深入研究。
　　因此，本研究将从抑制EBI两大主要损伤机制，即抗细胞死亡及抗神经炎症两个方面对褪黑素在SAH中的保护机制展开研究。第一部分研究将着眼于坏死性凋亡这种新型的细胞死亡方式，观察坏死性凋亡机制是否参与了SAH的致病过程，并且进一步探讨褪黑素治疗对于坏死性凋亡的作用及其可能机制。第二部分研究主要着眼于褪黑素调控NLRP3炎症小体介导炎症反应的可能机制。
　　方法:
　　第一部分
　　1.采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血（SAH）模型，成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机被分为假手术组（Sham组）和蛛网膜下腔出血组（SAH组）。SAH组按取材时间不同又分为蛛网膜下腔出血后6h组（SAH6h组）、蛛网膜下腔出血后12h组（SAH12h组）、蛛网膜下腔出血后24h组（SAH24h组）、蛛网膜下腔出血48h组（SAH48h组）和蛛网膜下腔出血后72h组（SAH72h组），通过蛋白质免疫印迹检测各组SD大鼠同侧大脑皮质内RIPK3蛋白含量;通过双重免疫荧光染色观察RIPK3的细胞定位;通过碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色鉴定坏死神经细胞及其与RIPK3的关系;通过透射电子显微镜(Transmission ElectronMicroscope，TEM)观察坏死神经细胞的超微结构变化。
　　2.成年雄性SD大鼠随机被分为假手术+溶剂组（Sham组），蛛网膜下腔出血+溶剂组（SAH+溶剂组），蛛网膜下腔出血+GSK872处理组（SAH+GSK872组），根据各分组不同的药物治疗情况，SAH模型建立后30分钟，应用立体定位下侧脑室注射法分别给予溶剂或RIPK3抑制剂GSK872，SAH后72小时通过免疫荧光等方法评估各组的细胞死亡，脑水肿和神经功能等情况。
　　3.成年雄性SD大鼠随机被分为假手术+溶剂组（Sham组），蛛网膜下腔出血+溶剂组（SAH+溶剂组），蛛网膜下腔出血+褪黑素处理组（SAH+Mel组），根据各分组不同的药物治疗情况，SAH模型建立后2小时、24小时和48小时，分别给予溶剂或褪黑素腹腔注射，SAH后72小时通过蛋白质免疫印迹、免疫荧光等方法评估各组相关蛋白的表达，细胞死亡，脑水肿和神经功能等情况。
　　4.成年雄性SD大鼠随机被分为蛛网膜下腔出血+溶剂组（SAH+溶剂组），蛛网膜下腔出血+褪黑素处理组（SAH+Mel组），蛛网膜下腔出血+褪黑素+3-MA处理组（SAH+Mel+3-MA组），根据各分组不同的药物治疗情况，SAH模型建立前20分钟，给予脑室内注射溶剂或3-MA，术后2小时，24小时和48小时，给予溶剂或褪黑素腹腔注射，SAH后72小时通过蛋白质免疫印迹、免疫荧光等方法评估各组相关蛋白的表达，细胞死亡，脑水肿和神经功能等情况。
　　第二部分
　　采用线栓穿刺法制作蛛网膜下腔出血（SAH）模型，成年雄性SD大鼠随机被分为假手术+溶剂组（Sham组），蛛网膜下腔出血+溶剂组（SAH+溶剂组），蛛网膜下腔出血+褪黑素处理组（SAH+Mel组）和蛛网膜下腔出血+褪黑素+3-MA处理组（SAH+Mel+3-MA组），根据各分组不同的标准，SAH模型建立前20分钟，给予脑室内注射溶剂或3-MA，术后2小时给予溶剂或褪黑素腹腔注射。24小时后获取大脑标本，通过脑含水量检测、活性氧测定、蛋白免疫印迹、免疫组织化学和透射电子显微镜等方法检测线粒体自噬、NLRP3炎症小体等相关指标。
　　结果:
　　第一部分
　　1.SD大鼠蛛网膜下腔出血后6个小时，脑组织中RIPK3的表达升高，12小时出现一个较小幅度的下降，接着再度上升，在72小时到达峰值。
　　2.通过PI染色及透射电镜观察到大鼠脑组织在蛛网膜下腔出血后72小时出现坏死的神经元，且RIPK3主要位于神经元中。
　　3.褪黑素能降低RIPK3和MLKL的表达，并减少坏死神经元的数量及HMGB1的释放。褪黑素能通过减少血脑屏障的破坏而减轻水肿，从而能够在蛛网膜下腔出血72小时后改善神经功能。
　　4.自噬抑制剂3-MA能逆转褪黑素对于缓解RIPK-3介导的坏死性凋亡的作用。
　　第二部分
　　1.SAH后褪黑素治疗上调线粒体自噬相关蛋白(PINK1/Parkin)，减轻线粒体损伤，减少ROS产生。
　　2.SAH后褪黑素治疗抑制NLRP3炎症小体激活，减少炎症反应。
　　3.SAH后褪黑素治疗减少神经细胞的死亡，减轻脑水肿和缓解神经功能障碍。
　　4.自噬抑制剂3-MA预处理可逆转褪黑素治疗对于NLRP3炎症小体活化的抑制作用。
　　结论:
　　1.本研究证实RIPK3介导的坏死性凋亡与SAH的早期脑损伤有关。褪黑素能减轻RIPK3介导的坏死性凋亡，减少HMGB1胞浆易位、保护血脑屏障及减轻脑水肿，从而改善SAH后的神经功能。而这其中潜在的机制可能与自噬的激活密切相关。
　　2.褪黑素介导的线粒体自噬相关蛋白上调能够在SAH后早期脑损伤中起到神经保护作用，并且该神经保护作用机制与抑制NLRP3炎症小体激活和减少炎症反应相关。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

引言

参考文献

第一部分 褪黑素在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中抗坏死性凋亡的机制研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 动物和实验分组

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂配置

2．5 实验方法

2．6 统计方法

3 结果

3．1 一般生理情况

3．2 死亡率

3．3 RIPK3表达随时间的变化情况

3．4 RIPK3的表达定位

3．5 坏死神经细胞及其超微结构

3．6 RIPK3抑制剂GSK872对SAH的影响

3．7 褪黑素对SAH的影响

3．8 3-MA对褪黑素保护作用的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 褪黑素在蛛网膜下腔出血早期脑损伤中抗神经炎症的机制研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 动物和实验分组

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂配置

2．5 实验方法

2．6 统计方法

3 结果

3．4 大鼠SAH模型制备情况及各组SAH评分

3．5 褪黑素治疗对SAH后脑水肿和神经功能障碍的影响

3．6 SAH后褪黑素治疗与自噬相关蛋白表达和ROS生成的关系

3．7 褪黑素治疗抑制SAH后NLRP3炎症小体和促炎细胞因子的变化

3．8 褪黑素治疗减轻SAH后神经细胞死亡

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

作者简历及在读期间取得的科研成果