蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞分泌的外泌体与NLRP3炎性体的相关性研究

摘要

目的：
　　本研究观察蓝光诱导后人视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）细胞分泌的外泌体（exosomes）与NLRP3炎性体的相关性，检测外泌体作用后RPE细胞中NLRP3表达水平的变化，进而探讨光氧化损伤的RPE细胞分泌的外泌体在年龄相关性黄斑变性发病中的生物学作用，为将外泌体引入 AMD的诊断、治疗及预后提供客观依据。
　　方法：
　　1．蓝光诱导RPE细胞模型的建立及有效性评价
　　培养ARPE-19细胞系，分为2组，一组建立蓝光诱导模型，将RPE细胞置于蓝光灯管下照射6h，另一组为正常对照，在正常细胞培养条件下培养，MTT法检测两组细胞的增殖活力。
　　2．外泌体的提取鉴定及NLRP3水平测定
　　应用分级低温超速离心的方法获得外泌体，透射电镜观察外泌体形态， Western Blot(蛋白免疫印迹)检测外泌体表面特异标志蛋白 CD63并且对比实验组和对照组外泌体中NLRP3炎性体相关的蛋白IL-1β、IL-18、caspase-1水平。
　　将实验组和对照组的外泌体分别作用于正常RPE细胞，MTT法对比作用后细胞增殖活力，Western Blot检测对比两组RPE细胞中NLRP3炎性体相关的蛋白IL-1β、IL-18、caspase-1水平，细胞免疫荧光检测验证两组RPE细胞内IL-1β、IL-18、caspase-1的水平的差异，rt-PCR检测两组RPE细胞中NLRP3 mRNA的表达水平。
　　3．蓝光诱导的RPE细胞的外泌体对正常RPE细胞的影响和作用
　　结果：
　　1.成功构建蓝光诱导的RPE细胞光氧化损伤模型,损伤后的RPE细胞肿胀，胞体失去多角形态，胞体变长，且与对照组相比，实验组RPE细胞的增殖活力明显减弱（P<0.05）。
　　2.应用低温超速分级离心法分离获得外泌体，电镜观察符合其形态特征， Western Blot检测到外泌体表面标志物CD63；实验组外泌体中NLRP3相关的蛋白IL-1β、IL-18和caspase-1水平均明显高于对照组（P<0.05）。
　　3.将蓝光诱导RPE细胞分泌的外泌体作用于正常 RPE细胞后，RPE细胞的增殖活力明显减弱（P<0.05），且RPE细胞中NLRP3相关的蛋白IL-1β、IL-18和 caspase-1分别高于对照组 RPE细胞（P<0.05）；细胞免疫荧光结果显示：实验组RPE细胞中IL-1β、IL-18、caspase-1的表达水平均明显高于对照组（P<0.05）；rt-PCR结果显示实验组和对照组RPE细胞的NLRP3 mRNA相对表达量分别为（1.0±0.069）和（0.2±0.01），差异有显著性（P<0.05）。
　　结论：
　　1.蓝光诱导的RPE细胞受到光氧化损伤，其分泌的外泌体中NLRP3炎性体相关的细胞因子IL-1β、IL-18和caspase-1表达上调；
　　2.将高表达NLRP3炎性体相关蛋白的外泌体作用于正常RPE细胞后，RPE细胞中NLRP3炎性体相关的细胞因子IL-1β、IL-18和caspase-1表达上调，RPE细胞内NLRP3 mRNA表达上调。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、蓝光诱导RPE细胞模型的建立及有效性评价

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、外泌体的提取鉴定及NLRP3水平测定

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4 小结

三、蓝光诱导的RPE细胞的外泌体对正常RPE细胞的影响和作用

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

全文结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 免疫活化和调节异常在年龄相关性黄斑变性发病中的作用研究进展

致谢

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