NGF、Noggin基因修饰的rBMSCs移植治疗帕金森病大鼠模型的实验研究

摘要

目的:1.通过立体定向技术将6-OHDA直接注射到前脑内侧束来建立一种简单、有效的PD大鼠模型，为下一步研究奠定基础。2.建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、扩增方法。3.判断重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-NOGGIN对rBMSCs的转染效率、转染对细胞的影响以及目的蛋白的表达情况。4.对比观察化学诱导剂、NGF及Noggin对rBMSCs像神经元样细胞方向分化的诱导作用。5.探讨携带NGF及Noggi n的rBMSCs对PD模型大鼠神经功能的修复作用及其机制。
　　 方法:1.应用6-OHDA立体定向颅内注射制备PD大鼠模型。用阿朴吗啡皮下注射检测造模是否成功。2.取SD大鼠长骨骨髓作为供体来源，经贴壁筛选法进行体外培养并纯化rBMSCs。通过细胞表面标志、成骨细胞诱导和成脂细胞诱导对培养的细胞进行鉴定。3.通过不同浓度的重组腺病毒选择转染最合适的MOI值。将rBMSCs分成5组分别为未转染组、Ad-GFP转染组、Ad-GFP-NGF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组和Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin联合转染组，观察转染对rBMSCs生长的影响，通过免疫荧光检测目的蛋白的表达。4.通过化学诱导剂和基因修饰诱导rBMSCs向神经元样细胞方向分化，并检测其神经细胞标志物的表达。5.通过立体定向颅内注射将经过基因修饰的rBMSCs移植入模型大鼠损毁侧纹状体。记录单位时间阿朴吗啡诱发的模型大鼠旋转次数，观察大鼠神经功能恢复情况。通过免疫荧光检测移植细胞在脑内存活、分布以及向神经元、星形胶质细胞方向分化的情况。免疫组化法检测细胞移植后第四周大鼠中脑黑质TH阳性细胞计数。通过高效液相检测大鼠纹状体DA、DOPAC、HVA含量。
　　 结果:1.6-OHDA颅内注射制备的帕金森病大鼠模型具有良好的稳定性，该模型的制备为下一步实验奠定了基础。2.贴壁法能够筛选获得纯度较高，活性良好的rBMSCs，具有相关表型，能向成骨细胞和成脂细胞分化。3.重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin在MOI=50pfu/cell条件下对rBMSCs转染效率高，对rBMSCs毒性最小。经NGF、Noggin修饰的重组腺病毒转染后的rBMSCs在发出绿色荧光的同时，能分别表达相应蛋白产物，免疫荧光染色呈红色荧光。联合转染组rBMSCs则同时呈现NGF、Noggin免疫荧光阳性反应。4.rBMSCs在化学诱导剂作用下，5h后出现神经元样形态，免疫荧光染色显示神经元标志物NF（H）呈阳性，星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性，但细胞大量死亡。各转染组rBMSCs中Ad-GFP转染组细胞形态无改变，Ad-GFP-NGF转染组、Ad-GFP-Noggin转染组及联合转染组rBMSCs在转染后72h呈现神经元样形态，部分细胞免疫荧光染色显示NF（H）阳性，GFAP阴性，分化后的细胞可长期存活。其中联合转染组NF（H）阳性率最高。5.经立体定向将细胞移植入模型大鼠损毁侧纹状体一周后，大鼠神经功能均有所改善，由阿朴吗啡诱发的旋转次数明显减少，其中联合转染组最为明显。镜下发现，移植细胞自注射部位向周围扩散，分布于纹状体、皮层下、海马及对侧半球。移植后两周，免疫荧光检测部分存活移植细胞NF（H）有阳性表达，另有部分细胞呈GFAP阳性。联合转染组NF（H）和GFAP阳性细胞比例最高。移植后四周，免疫组化检测各组模型黑质TH阳性细胞生存率，基因修饰组有增多的趋势，但各组差异无统计学意义。高效液相检测大鼠纹状体DA、DOPAC、HVA含量损毁侧同健侧之比，各细胞移植组比值均较未移植组和PBS组高，其中Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin联合转染组比值最高。
　　 结论:1.6-OHDA立体定向颅内注射法制备PD大鼠模型具有良好的稳定性及可重复性。2.通过贴壁筛选法能有效纯化骨髓，获得高纯度rBMSCs，并且该方法简单实用，对细胞影响小，能满足大多数研究需求。通过流式细胞技术检测细胞表面标志，以及成骨、成脂诱导能够对rBMSCs进行有效鉴定。3.重组腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin均能安全、有效地转染体外培养的大鼠BMSCs，并稳定表达GFP、NGF和Noggin蛋白。4.体外环境下，化学诱导剂和NGF和Noggin蛋白均能将rBMSCs诱导成为神经元样细胞，但化学诱导剂对细胞存活有明显影响，而后两者不影响细胞存活，并可促进细胞向神经元方向分化。5.立体定向将基因修饰的rBMSCs移植入大鼠损毁侧纹状体，移植细胞可在脑内存活、迁移并分化为具有神经元或星形胶质细胞表型的细胞，通过多种途径有效改善模型大鼠神经功能，促进DA的释放。