高压脉冲电场联合光动力疗法对乳腺癌的杀伤效应及其凋亡机制研究

摘要

不可逆电穿孔（Irreversible Electroporation，IRE）是一种新型肿瘤消融方法，在高压短脉冲电场作用下，细胞膜表面产生纳米级孔隙，进而导致细胞凋亡。该技术具有消融组织选择性，可保留消融区内大血管、神经等重要结构，无热沉效应，降低治疗后的炎症反应且减少疤痕形成，治疗时间短，可实时监测等优点。虽然IRE在治疗实体肿瘤方面表现出巨大潜力，但是IRE消融时残留肿瘤边界会影响肿瘤的治愈率，甚至可能导致肿瘤的复发。因此在实施 IRE时，治疗过度或治疗不足时有发生，单一IRE疗法缺陷明显。
　　光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）作为一种安全无副作用肿瘤治疗方法，光动力疗法具有照光区域可控的优点，与 IRE消融边界不完全的缺陷在理论上可以互补，同时 IRE对细胞膜的电穿孔特性在理论上可促进细胞对光敏剂的摄取。因此，本研究探讨高压脉冲电场联合光动力疗法在体内外对乳腺癌的杀伤效应及机制，以提高IRE的肿瘤治疗效果。
　　研究目的:
　　在细胞水平和动物水平上探讨高压脉冲电场联合光动力疗法对乳腺癌的杀伤效应，以寻求联合疗法的最佳配伍剂量，探究其凋亡机制。
　　研究方法:
　　在细胞水平，通过MTT法检测不同剂量下单独IRE，单独PDT和IRE+PDT对 MCF-7细胞的杀伤率，利用金氏公式评价不同剂量下 IRE+PDT疗法杀伤MCF-7细胞的联合疗效；利用流式细胞术，高内涵成像系统和激光扫描共聚焦显微镜等多种手段定性定量检测联合疗法引起的细胞凋亡，利用 real-timePCR和Western Bloting检测联合疗法作用后相关凋亡基因和蛋白的表达变化。
　　在动物水平，不同剂量 IRE+PDT联合疗法分别作用于荷瘤（BALB/C）小鼠的乳腺癌，观察并测量肿瘤体积变化来评价治疗效果，通过电镜超微结构、HE染色病理学改变、VEGF， CD31， TGF-β， Ki-67和TNF-α等细胞因子的免疫组化分析来研究其杀伤机制。
　　研究结果:
　　1.细胞实验表明 IRE+PDT联合疗法对乳腺癌细胞的杀伤有协同作用， IRE（380V）+PDT（10ug/ml）组的协同指数q达到1.32。
　　2.细胞实验中各组发生明显凋亡，联合治疗组的早凋率达到16%，显著高于单独IRE（7.6%）和单独PDT组（4.6%）（p<0.05）。
　　3. real-time PCR检测显示联合治疗组中 Casp1，3，5，6，7，8，9及TNFRSF1A等基因表达上调，Western Blot结果显示裂解Casp3，7，9，PARP蛋白表达量增加。
　　4.在体实验表明IRE+PDT联合疗法显著抑制肿瘤生长，IRE（1200V）+ PDT(10mg/kg*体重)组抑瘤率高达68.3%。
　　5.透射电镜和病理学结果表明肿瘤组织出现了不同程度的凋亡，联合治疗组的凋亡效果最明显。
　　6.免疫组化结果表明联合治疗组中新生血管指标 VEFG和 CD31、转移指标TGF-β以及细胞增殖指标Ki-67的表达量在术后1天均明显低于对照组，而炎性指标TNF-ɑ表达量在术后1天明显高于对照组。
　　研究结论:
　　在体内外实验中，IRE+PDT联合作用的杀伤效果和预后指标检测结果均优于单独IRE和单独PDT组，IRE+PDT联合疗法显著提高杀伤乳腺癌的效率，并且凋亡在杀伤乳腺癌的过程中扮演着重要角色，本研究为解决 IRE消融时存在肿瘤边界消融不完全的问题提供新的治疗方案，为其临床应用提供重要依据。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、高压脉冲电场联合光动力疗法对乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用

1.1材料、试剂和仪器

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

1.5 小结

二、高压脉冲电场对光敏剂的发射光谱和被摄取率的影响

2.1材料、试剂和仪器

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小结

三、不同剂量处理组对MCF-7细胞的凋亡作用检测

3.1材料、试剂和仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4讨论

3.5小结

四、不同剂量处理组对MCF-7细胞的凋亡机制研究

4.1材料、试剂和仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4讨论

4.5小结

五、高压脉冲电场联合光动力疗法对荷瘤小鼠的杀伤作用

5.1材料、试剂和仪器

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

5.5 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况

综述:不可逆电穿孔在肿瘤消融领域应用的研究现状

致谢

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