左卡尼汀改善子痫前期样小鼠妊娠结局的实验研究：循环及蜕膜单核巨噬细胞的变化及其潜在机制

摘要

研究目的：
　　子痫前期（Preeclampsia,PE）不仅是导致孕产妇死亡和围产儿死亡的主要原因，而且患者与其子代远期心血管疾病（Cardiovascular Disease,CVD）发病率明显增加。近年来研究显示循环单核细胞亚群及蜕膜巨噬细胞（Decidual Macrophage,DMs）M2表型偏移参与妊娠期间免疫抑制和螺旋动脉重塑，是成功妊娠的关键。左卡尼汀（L-Carnitine,LC）抗炎、抗氧化，应用于许多CVD中，同时还可以促进体外胚胎发育并提高体外受精成功率、上调组织PPAR-γ的表达。因此本研究通过观察LC对PE样小鼠妊娠结局及M2型DMs的影响，探索LC在PE中的应用前景及潜在机制，并探讨pStat6/Stat6-PPAR-γ信号通路在LC中介的干预效应中的作用。
　　内容与方法：
　　(1)7-8周龄雌性和雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养一周后，无创监测鼠尾血压，随机将血压稳定的雌鼠分为8组，分别为对照组（A组）、PE组[妊娠第7天（Gestation Day7, GD7）皮下注射L-NAME，B组]、PE+LC高剂量干预组（800mg/kg/d、C至E组）和PE+LC低剂量干预组（400mg/kg/d、F至H组）。C/F组、D/G、E/H组分别于孕前1周、GD0、GD9开始给予LC灌胃直至GD18结束妊娠。监测各组血压、24小时尿蛋白；高频小动物超声评价各组GD18血管功能；观察子代宫内生长发育状况以及胎盘/肾脏结构改变；分析A至E组外周血单核细胞Ly6Chi亚群、蜕膜巨噬细胞表型偏移的变化；检测A至E组血浆氧化三甲胺（Trimethylamine Oxide,TMAO）浓度；监测B组和C组动脉粥样硬化程度；检测A至E组粪便16S rDNA分析菌群分布情况。
　　(2)L-NAME、LC以及GW9662（PPAR-γ阻滞剂）共同干预RAW264.7细胞，观察iNOS、IL-1β、TNF-α、CD206、ARG1、IL-10和PPAR-γmRNA表达水平以及PPAR-γ和Stat6信号通路相关蛋白pStat6/Stat6表达水平，探索LC对小鼠巨噬细胞表型偏移的影响及其机制。
　　结果：
　　(1)L-NAME可以引起C57BL/6J小鼠PE样表现，如高血压、蛋白尿、宫内生长受限和血管功能受损等，同时还可以诱导外周血Ly6Chi单核细胞亚群增加，蜕膜巨噬细胞M2表型偏移减少。Ly6Chi亚群与血压、蛋白尿呈正相关；与胎鼠重、顶臀长和胎盘直径呈负相关（r=0.6363,r=0.6752,r=-0.6694,r=-0.6623,r=-0.6623,all P<0.001）；蜕膜组织巨噬细胞M2表型与血压、蛋白尿呈负相关，与胎鼠重、顶臀长和胎盘重呈正相关（r=-0.5214,r=-0.6562,r=0.4882,r=0.5701,r=0.5701,all P<0.05）。
　　(2)不同时间点给予不同剂量LC可以不同程度降低PE样小鼠血压、24小时尿蛋白，改善血管内皮功能，改善子代宫内生长受限，降低脐动脉和子宫-胎盘动脉的搏动指数（Plusatility Index,PI）和阻力指数（Resistance Index,RI）；LC改善围产期结局的程度随着LC剂量的增加而增加，差异有统计学意义（all P<0.05）。
　　(3)流式细胞术分析结果显示与A组相比，B组外周血单核细胞Ly6Chi亚群升高（61.7±8.66%vs.72.2±6.02%），蜕膜组织巨噬细胞M2表型表达减少（65.4±9.66 vs.53.7±4.08），差异有统计学意义（all P<0.01）。孕前1周给予高剂量LC后Ly6Chi亚群比例下调（72.2±6.02%vs.61.25±3.21%），蜕膜巨噬细胞M2表型表达增加（53.7±4.08 vs.65.8±6.14），差异有统计学意义（all P<0.01）。B组蜕膜组织M1表型标志物（TNF-α、IL-1β、iNOS）基因相对表达量较对照组增加，差异有统计学意义（1.00 vs.1.41±0.15;1.00 vs.5.35±1.14;1.00 vs.81.3±16.3;all P<0.001）；孕前1周、GD0给予高剂量LC干预后TNF-α、IL-1β、iNOS基因表达量均下降，差异有统计学意义（1.42±0.15 vs.0.34±0.14;5.35±1.14 vs.3.64±1.13;81.3±16.3 vs.8.84±1.41;all P<0.001；1.42±0.15 vs.0.41±0.11;5.35±1.14 vs.4.39±0.89;81.3±16.3 vs.12.32±1.04;all P<0.05）；GD9给予高剂量LC干预后iNOS基因表达量下降，差异有统计学意义（81.3±16.3 vs.20.2±3.37;P<0.001）。B组蜕膜组织M2表型标志物CD206基因相对表达量较A组下调，差异有统计学意义（1.00 vs.0.60±0.17;P<0.001）；IL-10、ARG1基因表达量与对照组差异无统计学意义（1.00 vs.1.46±0.31;1.00 vs.1.04±0.15;P>0.05）；孕前1周给予高剂量LC干预后CD206、IL-10基因表达量上升，差异有统计学意义（0.60±0.17 vs.1.00±0.20;1.46±0.31 vs.2.57±0.66;all P<0.001）；GD0给予高剂量LC干预后，IL-10基因表达量上升，差异有统计学意义（1.46±0.31 vs.1.77±0.48;P<0.05）。
　　(4)蜕膜组织M2型巨噬细胞与孕鼠GD18血压、24小时蛋白尿呈负相关（r=?0.5196,P<0.001;r=?0.5132,all P<0.001）；与胎鼠重、顶臀长呈正相关（r=0.5408,r=0.5779,all P<0.001）。
　　(5)围产期LC总量与蜕膜M2型巨噬细胞呈正相关（r=0.59,P<0.001）；与蜕膜组织TNF-α、IL-1β、iNOS基因表达量呈负相关（r=?0.80,r=?0.50,r=?0.96,all P<0.001）；与蜕膜组织CD206、IL-10基因表达量呈正相关（r=0.47,r=0.53,all P<0.001）。
　　(6)L-NAME可刺激RAW264.7细胞系M1巨噬细胞表型标志物（TNF-α、IL-1β、iNOS）基因表达量增加，差异有统计学意义（1.00 vs.1.56±0.19;1.00 vs.1.82±0.42;1.00 vs.3.90±0.80;all P<0.05）；联合LC干预后TNF-α表达量下降，差异有统计学意义（1.56±0.19 vs.0.81±0.16;P<0.01），IL-1β、iNOS表达量有下降趋势，但差异无统计学意义（1.82±0.42 vs.1.58±0.42;2.67±0.80 vs.3.90±0.80;all P>0.05），M2巨噬细胞表型标志物CD206、IL-10和ARG1基因表达量以及PPAR-γ基因表达量增加，差异有统计学意义（1.50±0.70 vs.6.43±1.36;3.45±0.65 vs.5.51±1.84;1.11±0.20 vs.2.21±0.53;1.02±0.27 vs.1.47±0.28;all P<0.05）；同时给予L-NAME、LC和GW9662（PPAR-γ阻滞剂）干预后M1、M2巨噬细胞表型标志物和PPAR-γ基因表达量与单纯L-NAME刺激组相似，差异无统计学意义（all P>0.05）；L-NAME+LC组PPAR-γ和Stat6信号通路相关蛋白pStat6/Stat6表达水平较对照组增加，差异有统计学意义（all P<0.05）；加用GW9662后上述蛋白表达量下降，与对照组差异无统计学意义（all P>0.05）。
　　(7)A至E组血浆TMAO浓度差异无统计学意义；B组与C组相比主动脉瓣、主动脉及其主要分支动脉粥样硬化差异无统计学意义（all P>0.05）。A至E组小鼠粪便16S rDNA高通量测序结果显示各组厚壁菌门和拟杆菌门占主要门类分布，组间差异无统计学意义，与血浆TMAO、围产期服用LC总量无相关性；属水平组间梭状芽胞杆菌、甲型变形菌纲、梭菌属XlVa、厌氧细杆菌属、棍状厌氧菌、欧陆森氏菌属和八叠球菌属差异有统计学意义，其中欧陆森氏菌属与围产期口服LC总量呈负相关（r=-0.7989, P<0.01）。
　　结论：
　　本研究结果显示孕鼠GD7皮下注射L-NAME可以引起PE样表现，是比较合理的PE样模型。LC可能通过pStat6/Stat6-PPAR-γ信号通路介导蜕膜巨噬细胞M2表型偏移，改善PE样小鼠围产期妊娠结局；PE样小鼠孕前1周给予口服LC直至GD18结束妊娠（800 mg/kg/d）对动脉粥样硬化的发生发展无明显影响，提示LC可能是防治PE的一个新的方法。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、 子痫前期样小鼠模型建立和评价

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、 LC对子痫前期样小鼠围产期临床表现与妊娠结局的影响

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、 围产期LC肠道代谢产物对动脉粥样硬化的影响

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

全文结论

论文创新点

论文局限性

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:妊娠与免疫细胞

致谢

个人简历