低氮或高碳促进红发夫酵母合成虾青素的初步研究

摘要

本文通过改变培养基的初始氮(硫酸氨)和碳(葡萄糖)浓度，发现低氮或高碳能够促进红发夫酵母合成虾青素。保持培养基中葡萄糖浓度恒定(20 g/L)，当硫酸氨浓度为1 g/L时，红发夫酵母的生物量下降，但最大虾青素含量比硫酸氨浓度为5g/L和20 g/L时分别增加11％和30％，达到0.52 mg·g-1DCW；保持硫酸氨浓度恒定(5 g/L)，当葡萄糖浓度为40 g/L时，红发夫酵母的最大虾青素含量比葡萄糖浓度为5 g/L和20 g/L时分别增加9％和24％，达到0.51 mg·g-1DCW。 运用代谢通量分析的方法，定量分析不同氮、碳浓度下红发夫酵母的中心碳代谢发现：(1)红发酵母的磷酸戊糖途径的通量都相当的高，这与红发夫酵母的生理特点相吻合。红发发酵母是一种富含脂质的酵母，磷酸戊糖途径是其细胞质中NADPH的主要来源。磷酸戊糖途径的高通量，就为其脂肪酸和虾青素的合成提供了充足的还原力。(2)生成乙酰辅酶A的总反应的通量与合成虾青素反应的通量正相关，并且这两个通量都随培养基中初始氮浓度的降低而升高，随初始葡萄糖浓度的增加而增加，这说明乙酰辅酶A是红发夫酵母合成虾青素的一个限制因素。 通过测定红发夫酵母丙酮酸代谢相关酶的活性，发现红发夫酵母的丙酮酸代谢有多条去路，但参与丙酮酸脱氢酶旁路的两种酶--乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶在红发夫酵母中的活性极低。然而，柠檬酸裂解酶的活性较高，并且与红发夫酵母虾青素的合成明显呈正相关。酶活分析结果说明，柠檬酸裂解酶催化的裂解反应是红发夫酵母乙酰辅酶A的重要来源。柠檬酸裂解反应决定着红发夫酵母细胞质中乙酰辅酶 A 的供给，从而显著影响着其虾青素的合成。低氮或高碳培养条件能够提高柠檬酸裂解酶的活性，增加乙酰辅酶A的供给，从而促进红发夫酵母合成虾青素。

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声明

第一章文献综述

1.1虾青素的化学性质、功能和应用

1.1.1虾青素的化学性质

1.1.2虾青素的功能

1.1.3虾青素的应用

1.2虾青素在自然界的分布

1.2.1雨生红球藻

1.2.2红发夫酵母

1.3红发夫酵母的基本特性

1.3.1红发夫酵母的营养组成

1.3.2红发夫酵母中虾青素的合成途径

1.4培养条件对红发夫酵母虾青素合成的影响

1.4.1光照

1.4.2温度

1.4.3 pH值

1.4.4碳氮比

1.5丙酮酸代谢

1.6乙酰辅酶A的转运

1.7代谢通量分析

1.8本课题的主要研究内容

第二章实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

2.1.2实验仪器

2.1.3药品与试剂

2.1.4培养基

2.2实验方法

2.2.1菌种活化

2.2.2种子培养

2.2.3发酵培养

2.2.4虾青素含量的测定

2.2.5葡萄糖浓度的测定

2.2.6丙酮酸的测定--高效液相色谱的法

2.2.7菌体生物量测定

2.2.8粗酶液的制备

2.2.9酶活力测定

2.2.10蛋白质浓度的测定--考马斯亮蓝法

第三章氮浓度对红发夫酵母虾青素合成的影响

3.1不同氮浓度下红发夫酵母的摇瓶培养

3.1.1 (NH4)2SO4浓度对红发大酵母的生长和葡萄糖消耗的影响

3.1.2(NH4)2SO4浓度对pH值以及红发夫酵母虾青素积累的影响

3.2红发夫酵母中心碳代谢网络的建立及代谢通量分析

3.2.1红发夫酵母中心碳代谢网络的建立

3.2.2红发夫酵母生物质合成前体需求系数的计算

3.2.3红发夫酵母代谢通量平衡模型的建立

3.2.4代谢通量分析不同氮浓度下红发夫酵母的中心碳代谢

3.3氮浓度对于红发夫酵母丙酮酸代谢相关酶活性的影响

3.3.1 24 h培养物的粗酶液中丙酮酸代谢相关酶的活性

3.3.2 42 h培养物的粗酶液中丙酮酸代谢相关酶的活性

3.3.3红发夫酵母的丙酮酸代谢及其与虾青素合成的关系

3.3.4低氮促进红发夫酵母虾青素合成的机理

第四章葡萄糖浓度对红发夫酵母虾青素合成的影响

4.1不同葡萄糖浓度下红发夫酵母的摇瓶培养

4.1.1葡萄糖浓度对红发夫酵母生长和葡萄糖消耗的影响

4.1.2葡萄糖浓度对pH值以及红发夫酵母虾青素积累的影响

4.2代谢通量分析不同葡萄糖浓度下红发夫酵母的中心碳代谢

4.3葡萄糖浓度对红发夫酵母丙酮酸代谢相关酶活性的影响

4.3.1 24 h培养物的粗酶液中丙酮酸代谢相关酶的活性

4.3.2 42 h培养物的粗酶液中丙酮酸代谢相关酶的活性

4.3.3从丙酮酸代谢角度分析高碳促进红发夫酵母虾青素合成

第五章结论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢