猪卵巢组织玻璃化冷冻保存研究

摘要

卵巢组织的冷冻保存是在胚胎和卵母细胞冷冻保存的基础上建立的又一种保护动物遗传资源的方法。利用简捷有效的玻璃化冷冻保存技术，可以对突然死亡的珍稀物种或稀有突变体动物的卵巢予以及时的冻存，并在解冻后通过移植体外受精等技术获得该物种。卵巢组织冷冻保存技术在保持生物多样性方面具有重要意义，对胚胎工程学及生殖生物学的研究有着重要的意义。 本研究采用乙二醇(EG)和二甲基亚砜(DMSO)混合作为玻璃化冷冻保护剂，将猪卵巢组织经过不同浓度的平衡液中处理后进行玻璃化冷冻保存，研究了不同的玻璃化冷冻法对猪卵巢冷冻保存后的组织学结构、卵泡的影响；同时，对冷冻保存的猪卵巢解冻后卵母细胞的存活率、体外受精后的卵裂、胚胎发育状况进行了研究。研究的主旨在于探讨卵巢组织玻璃化冷冻保存的方法和较理想的冷冻保护液，为濒危物种的卵巢冷冻技术奠定有效的技术方法和数据支持。通过研究，结果如下： 1．玻璃化冷冻保存的猪卵巢组织形态学研究 比较不同玻璃化冷冻方法对猪卵巢组织形态的影响。结果显示，冷冻保护剂处理的猪卵巢皮质部卵泡与新鲜卵巢皮质部卵泡的结构无明显差异，卵母细胞保持圆形，周围颗粒细胞形态正常；二步平衡组的卵巢组织切片中卵泡形状正常，卵泡周围的颗粒细胞完整、其周围有较多的疏松的颗粒细胞，其外围有较为致密的颗粒细胞，有少量卵母细胞体积变小，与周围的颗粒细胞之间形成较大的空隙，部分组织块的间质组织比较疏松；一步平衡组有卵泡形态不规则，周围的颗粒细胞排列松散甚至缺失，卵母细胞的细胞质萎缩，其周围不见致密的颗粒细胞。EG与DMSO混合作为玻璃化冷冻保护剂，两步平衡玻璃化冷冻方法可用于猪卵巢组织的冷冻保存。 2. 玻璃化冷冻保存的猪卵巢内卵母细胞的存活率检测 玻璃化冷冻保存的卵巢解冻后的功能如何，取决于其内分泌功能的恢复及卵巢内卵母细胞的存活。本研究对不同方法玻璃化冷冻保存的猪卵巢组织内卵母细胞，分别进行台盼蓝染色检测卵母细胞的存活率，实验结果表明，对照组卵巢内卵母细胞的存活率为94.087％，高于保护剂处理组卵巢内卵母细胞的存活率74.129％(P<0.05)，一步平衡冷冻组卵母细胞存活率为13.657％，二步平衡冷冻组卵母细胞的存活率为18.250％，两组之间无显著差异；冷冻保存的卵巢内卵母细胞的存活率显著低于对照组和处理组(P<0.05)；显示，二步冷冻法玻璃化冷冻保存的卵巢内卵母细胞的存活率高于一步平衡冷冻法。 3．玻璃化冷冻保存的猪卵巢内卵母细胞的体外受精 卵母细胞的有效利用，在于其具有一定的发育能力，本研究在以上研究的基础上，进一步对玻璃化冷冻保存的卵巢内卵母细胞的体外受精能力及其胚胎发育状况进行了研究，结果证明，对照组、处理组与冷冻组之间的卵裂率差异显著，对照组卵裂率明显高于处理组，而处理组的卵裂率明显高于两个冷冻保存组。其中，二步平衡法冷冻保存组的卵裂率9.028％稍高于一步平衡法冷冻组的卵裂率3.403％，但是这两个冷冻组都没有得到囊胚，说明冷冻玻璃化冷冻保存对卵巢内卵母细胞的发育能力有一定的影响。 以上结果显示，使用EG与DMSO混合的玻璃化冷冻保护剂，经二步平衡法玻璃化冷冻法保存猪卵巢组织，解冻后组织形态、卵泡结构无明显损伤；卵巢组织内卵母细胞具有一定的存活力和受精能力。