荷电脂质对重组细菌视紫红质蛋白活性的影响

摘要

细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin, BR)蛋白是嗜盐菌紫膜上的唯一蛋白,具有光驱质子泵活性。受到光激发时,BR蛋白将经过由K,L,M,N,O等瞬间中间态组成的光循环过程。M中间态对应于BR蛋白向胞外的质子释放过程。本论文利用去垢剂透析法将BR蛋白重组于不同处方、不同荷电脂质比例的脂质体中,研究了BR在非光照条件下输送氢离子的活性、荷电脂质对蛋白重组机制以及重组BR蛋白光循环活性的影响。细菌视紫红质蛋白在避光条件下,有助于氢离子的过膜扩散。这可能是因为：(1)BR具有质子通道作用,即使在非光照条件下,亦能输送氢离子过膜。(2)BR与脂质膜的结合致使脂质膜致密性改变。在脂质膜组分中加入阴离子脂质,BR脂质体的氢离子通透性随着阴离子电荷的增加而减小,当阴离子脂质比例达到20%时,BR脂质体的氢离子通透性甚至略低于空白脂质体。与此同时,阳离子脂质成分的添加亦降低了氢离子通透性,但随着其比例的增加(10%~30%),蛋白脂质体通透性基本不变。重组过程中,随着脂质膜中阳离子脂质比例的增加,膜上反向组装的BR蛋白的比例也随之增加。在阴离子脂质环境中,细菌视紫红质蛋白则倾向于正向组装；但是,即使在100%阴离子条件下,蛋白也不能完全实现正向排列。此发现表明电荷是BR重组过程中的重要影响因子,对膜蛋白体外研究模型的构建及优化提供了有效信息。不同处方的荷电蛋白脂质体上,细菌视紫红质蛋白的M态衰减曲线有所差异。随着脂质体中阳离子成分的增加(0~60%),其上重组BR蛋白的M态衰减时间也延长；而当增加阴离子比例时(0~60%),M中间态衰减时间缩短。我们推测,微环境中的离子浓度变化导致蛋白内的电荷分布改变,从而影响其光循环。

目录

摘要

Abstract

第一章 前言

1. 细菌视紫红质蛋白

1.1 嗜盐菌( Halophiles)概述

1.2 细菌视紫红质蛋白的结构

1.3 细菌视紫红质蛋白的质子泵机理

1.4 细菌视紫红质蛋白的应用

2. 蛋白重组脂质体的制备和研究

2.1 脂质膜的组成

2.2 蛋白重组脂质体的制备方法

3. 本论文的研究背景和主要内容

参考文献

第二章 细菌视紫红质蛋白的提取及蛋白脂质体的制备

1. 前言

2. 实验材料及方法

2.1 实验材料

2.2 缓冲溶液

2.3 实验仪器

2.4 实验方法

3. 实验结果及讨论

3.1 细菌视紫红质蛋白的提取

3.2 紫外分光光度计分析

3.3 蔗糖梯度离心及SDS-PAGE

3.4 空白及蛋白脂质体的粒径比较

3.5 荷电蛋白脂质体的粒径比较

3.6 荷电蛋白脂质体电动电势（Zeta Potential）检测

4. 小结

参考文献

第三章 蛋白脂质体质子通透性研究

1. 前言

2. 实验材料及方法

2.1 实验材料

2.2 缓冲溶液

2.3 实验仪器

2.4 实验方法

3. 实验结果及讨论

3.1 pH～F415/450 标准曲线

3.2 重组蛋白脂质膜的氢离子通透性及中性脂质组分的影响

3.3 重组蛋白脂质膜的氢离子通透性及带电荷脂质组分的影响

3.4 膜上重组蛋白的结构变化及脂质体的泄漏

4. 小结

参考文献

第四章 荷电脂质对BR 蛋白脂质膜组装机制及蛋白M 态衰减曲线的影响

1. 前言

2. 实验材料及方法

2.1 实验材料

2.2 缓冲溶液

2.3 实验仪器

2.4 实验方法

3. 实验结果及讨论

3.1 脉冲光照下荷电脂质体中BR 的质子提取及释放

3.2 持续光照下荷电脂质体中BR 的质子泵活性

3.3 阳离子脂质体中BR 蛋白N 中间态的变化

3.4 蛋白脂质体中荷电脂质含量与BR 蛋白M 态衰减曲线的关系

4. 小结

参考文献

第五章 总结与展望

1. 本论文的主要结论及意义

2. 本论文的创新之处

3. 展望

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢