不同来源成体干细胞体外诱导向胰岛β细胞的实验研究

摘要

目的：每年有数以百万的人们被诊断患有I型糖尿病，I型糖尿病是一种自身免疫性疾病，即为胰岛素依赖性糖尿病，目前的研究表明，可能是由于自身免疫性破坏导致胰岛β细胞受损所造成的，所以患者需要终身注射胰岛素，并且没有治疗这种疾病的好方法。最近几年世界上的研究表明，通过移植多向分化潜能的祖干细胞来治疗I型糖尿病，成为一种新的治疗手段。干细胞在来源上可分为胚胎干细胞与成体干细胞，因胚胎干细胞用于临床产生诸多伦理道德等问题的争议，所以选择成体干细胞进行细胞治疗的种子，是不错的选择。本课题采用的三种成体干细胞分别为经血源子宫内膜干细胞（MENSC）、脐带间充质干细胞（UCMSC）与牙髓间充质干细胞（DPSC）；其中MENSC源于女性经血的间充质干细胞，其取材方便来源广泛，UCMSC取自于妊娠后妇女的脐带，利用“组织植块法”分离得到，DPSC来源于磨牙的牙髓，该三种成体干细胞均具有低免疫原性、高增殖力、多向分化潜能等特性。本课题在于比较以上三种不同来源的成体干细胞体外诱导向胰岛β细胞的分化能力差异，为后续临床前实验做基础，也为干细胞治疗的理想种子细胞筛选基础性研究。
　　方法：1、比较MENSC、UCMSC与DPSC的生物学基本特性，采用生长动力学实验方法，计算并绘制生长曲线和最大比生长率，利用流式细胞术实验方法鉴定并分析三种成体干细胞的表面抗原标记物。
　　2、多向分化潜能的实验比较三种不同来源的成体干细胞，骨方向分化和成脂方向分化的体外实验研究。其中成骨分化实验中，在分化末期通过茜素红染色及半定量分析，比较差异性；成脂分化实验中，在分化末期通过油红O染色及半定量分析，比较三种间充质干细胞的多能分化差异性。同时验证MENSC，UCMSC与DPSC的多能分化能力。
　　3、采用“三步法”体外定向诱导MENSC、UCMSC与DPSC向胰岛样细胞分化，并通过 I型鼠尾胶原提供干细胞三维生长环境；通过形态学、DTZ染色、免疫荧光分析、荧光定量PCR与ELISA等多方面评价诱导效果。
　　结果：1、经分离提取的原代MENSC、UCMSC与DPSC细胞形态总体为梭形，其中UCMSC的细胞形态更为细长，MENSC的细胞形态更为饱满，DPSC细胞形态则相对偏小；生长动力学中，MENSC细胞倍增时间为65.5 h，UCMSC细胞倍增时间为44.3h，DPSC细胞倍增时间为53.5h；最大比生长率分别为0.0106 s-1、0.0156 s-1与0.0130 s-1。三种干细胞均阳性表达的间充质表面抗原物为 CD29，CD44，CD90，阴性表达 CD14，CD34，CD45，证明三种干细胞具有较低的免疫原性。
　　2、三种成体间充质干细胞均具有成骨和成脂分化潜能。其中在成骨分化中，脐带间充质干细胞（UCMSC）与牙髓间充质干细胞（DPSC）诱导能力优于子宫内膜干细胞（MENSC）；成脂分化中，子宫内膜干细胞（MENSC）与脐带间充质干细胞（UCMSC）分化能力优于牙髓间充质干细胞（DPSC）。
　　3、三种间充质干细胞进行“三步法”诱导后，子宫内膜干细胞（MENSC）形成类圆球形（Langerhans）胰岛细胞团的效果优于脐带间充质干细胞（UCMSC）与牙髓间充质干细胞（DPSC）；经过双硫腙（DTZ）染色后，诱导后的MENSC胰岛样细胞团呈现深红色，而UCMSC与 DPSC诱导后形成的细胞团并为能染色呈现深红色。MENSC进行免疫荧光检测，胞外胰岛素表达为阳性，UCMSC表达为阴性，DPSC表达量极其微弱。ELISA检测结果显示，MENSC在经诱导后，胰岛样细胞团在高糖刺激情况下，胰岛素分泌量为11.95 mU/L，低糖诱导下胰岛素分泌量为3.46 mU/L；UCMSC分别在高糖培养基刺激和低糖刺激下，胰岛素的分泌量为6.61 mU/L与2.75 mU/L；DPSC分别在高糖刺激和低糖刺激下，胰岛素的分泌量为5.26 mU/L与4.11 mU/L。其中只有MENSC经过诱导后形成的胰岛样细胞分泌量与葡萄糖的浓度成正相关。荧光定量PCR显示MENSC在三步诱导后INS，NGN3以及GLUT-2呈阳性表达，而UCMSC实验组弱于对照组的表达，DPSC仅有NGN3表达量高于对照组。
　　结论：本课题比较了三种不同来源的成体间充质干细胞在体外定向诱导胰岛β细胞分化能力的差异性，根据形态学、DTZ染色、免疫荧光蛋白检测、Q-PCR与ELISA共同结果分析可得，子宫内膜干细胞在“三步法”诱导体系中，效果更好，优于脐带间充质干细胞与牙髓间充质干细胞，更适合作为临床应用于治疗糖尿病的种子细胞。

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符号说明

第一章 研究背景

引言

1.1干细胞概述

1.2间充质干细胞定向诱导胰岛样细胞分化研究现状

第二章 三种成体间充质干细胞的分离鉴定

2.1实验材料和试剂

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小结

第三章 三种成体间充质干细胞的多向分化潜能

3.1实验材料和试剂

3.2实验方法与步骤

3.3实验结果

3.4讨论

3.5小结

第四章 体外诱导三种成体间充质干细胞向胰岛样细胞的分化

4.1主要试剂和药品

4.2实验方法

4.3实验结果

4.4讨论

4.5小结

实验结论

第五章 工作展望

5.1本课题的创新点

5.2后续研究工作展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文