转lgtC基因甜菜糖分分析和转乳糖合成酶基因甜菜的获得

摘要

Globotriose是一种具有重要价值的寡糖。在大肠杆菌中，在外源添加乳糖情况下，它的合成需要3个关键酶基因：（1）susA，编码Sucrose synthase（EC2．4．1．13）；（2）galE，编码UDP-galactose4-epimerase（EC5．1．3．2）；（3）ιgtC，编码α-1，4-galactosyltransferase（EC2．4．1．x）。在植物中，Globotriose因缺少ιgtC酶和乳糖而不能被合成。 ιgtC基因，来自奈瑟氏脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis），该酶催化从UDP-Gal上转移一个半乳糖残基到乳糖末端上。本工作以转ιgtC基因的甜菜植株为材料，研究甜菜细胞糖组分的变化，探求ιgtC基因对转基因植株代谢和生长发育的影响。 为了准确测定转基因甜菜的可溶性总糖组成和含量，本工作利用薄层层析方法分离和鉴定转基因植株的各种糖分，同时采用高效液相色谱分离和示差折光检测器测定技术定量叶片提取液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量，采用反向高效液相色谱分离和光电二极管阵列检测器测定UDP-半乳糖的含量。 人的乳糖合成酶由二亚基组成，其调节亚基为乳清蛋白（α-lactalbumin），由LALBA基因编码；催化亚基为β-1，4-galactosyltransferase（EC2．4．1．22），由Gal-T1基因编码，催化从UDP-Gal上转移一个半乳糖残基到葡萄糖末端上合成乳糖。本工作拟以转ιgtC基因的甜菜丛生芽为受体将LALBA、Gal-T1基因转入甜菜，探讨利用转基因甜菜合成乳糖、Globotriose的可行性。 1.转ιgtC基因甜菜糖分的分析 首先用RT-PCR方法筛选出ιgtC基因高效表达的甜菜转基因株系，然后对这些株系进行可溶性总糖、单糖和二糖以及核苷糖测定分析，结果显示转正义基因的株系无论叶中还是块根中的可溶性总糖含量均较野生型株系显著提高，相应的葡萄糖、果糖和蔗糖含量与野生型株系相比也均有不同程度的提高；转基因株系UDP-半乳糖含量与对照相比显著降低；而转反义基因株系的可溶性总糖、UDP-糖以及其它糖分含量均与野生型植株无明显差异。 转基因植株生长发育观察和光合作用测定表明，向甜菜中转入来源于原核生物的ιgtC基因未影响植株的生长发育和光合作用。 2.转乳糖合成酶基因甜菜的获得 从人的cDNA文库（Marathon-Ready cDNA）中克隆得到乳糖合成酶基因（LALBA基因、Gal-T1基因），构建双基因串联的植物表达载体并转化已有的转ιgtC基因甜菜丛生芽，获得聚合三个基因的甜菜植株。 建立起四个转，ιgtC正义基因株系的离体丛生芽体系，经过继代培养发现，4个株系L1、L2、L3、L4与WT都有丛生芽发生，诱导时间相差不大，其中株系L2不定芽的发生时间较早。培养6周后，不同株系的诱导率均大于86％。随着丛生芽块继代培养时间的延长，不同株系间出现差异。有的株系的单芽在继代培养过程中增殖迅速，发生次生芽较多，而有些株系的单芽生长虽快但较少发生次生芽。 选取ιgtC基因表达活性较高且次生芽增殖迅速的株系L2、L4的丛生芽，通过农杆菌介导法将乳糖合成酶基因引入甜菜，经PCR检测获得了聚合三个基因（LALBA、Gal-T1、ιgtC）的甜菜植株。 本论文以ιgtC基因和从人cDNA文库中分离的乳糖合成酶基因为目标基因，利用甜菜细胞为受体，获得了转入单个或数个目标基因的植株，同时研究了转基因植株中糖代谢途径的改变对糖分积累、生长发育的影响，为探测甜菜细胞糖代谢途径调控机制的研究提供了适宜的材料，同时为利用甜菜作为生物反应器生产高附加值寡糖、特别是Globotriose等奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分前言

1.1植物生物反应器研究进展

1.1.1植物生物反应器的优点

1.1.2植物反应器生产碳水化合物

1.1.3植物反应器生产药物蛋白

1.1.4植物反应器生产贮藏蛋白

1.1.5植物生物反应器生产脂类物质

1.1.6植物生物反应器生产次生代谢物

1.2几种主要的植物生物反应器

1.3 Globotriose的研究进展

1.4 lgtC基因研究进展

1.5乳糖合成酶研究进展

1.5.1 LALBA基因研究进展

1.5.2 β-1，4-半乳糖基转移酶基因研究进展

1.6可溶性糖在植物代谢调节中的生理作用

1.6.1可溶性糖与渗透调节

1.6.2可溶性糖与信号转导

1.6.3可溶性糖与激素

1.6.4糖信号与氮信号的互作及对同化物分配的调控

1.7转基因甜菜研究进展

1.7.1抗除草剂转基因研究

1.7.2抗病转基因研究

1.7.3抗虫转基因研究

1.7.4其它转基因研究

1.8本工作的目的与意义

第二部分转lgtC基因甜菜糖分的分析

2.1材料与方法

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3药品、试剂和溶液

2.1.4转基因植株的分子检测

2.1.5转基因植株糖分含量测定

2.1.6光合速率的测定

2.2结果

2.2.1转基因植株的分子检测

2.2.2转基因植株的生长发育状态统计

2.2.3转基因植株含糖量

2.2.4光合作用测定结果

第三部分转乳糖合成酶基因甜菜的获得

3.1材料与方法

3.1.1质粒、菌株及培养基

3.1.2药品及试剂

3.1.3人的LALBA基因与Gal-T1基因的克隆

3.1.4植物表达载体的构建

3.1.5农杆菌介导的甜菜遗传转化

3.1.6转乳糖合成酶基因甜菜的分子检测

3.2结果与分析

3.2.1人的LALBA基因和Gal—T1基因的克隆

3.2.2植物表达载体的构建

3.2.3重组质粒的限制性酶切鉴定

3.2.4甜菜丛生芽体系建立及丛生芽遗传转化

3.2.5甜菜芽尖的浸染转化及植株再生

3.2.6转化植株的分子检测

第四部分讨论

4.1转lgtC基因对甜菜植株糖组分的影响

4.2转lgtC基因对甜菜植株生长发育的影响

4.3转乳糖合成酶基因甜菜的获得

参考文献

致谢