土壤氨氧化过程和欧洲亚硝化单胞菌对重金属的响应研究

摘要

近年来，随着全世界范围内污水灌溉、农药和化肥的大量使用，以及采矿、冶金业的迅速发展，造成重金属以各种形式进入大气、水、土壤中，引起环境污染。这些重金属污染物进入土壤后对土壤生物及土壤微生物产生严重的负面影响。硝化作用在氮循环中具有重要作用，并且硝化作用对重金属胁迫非常敏感，也是对重金属最敏感的土壤微生物过程之一。现在已有的研究结果表明重金属污染对土壤微生物群落结构、微生物生物量、基础呼吸、营养物质矿化作用、CO2代谢商、土壤酶活性等都产生了影响，并且高浓度重金属对微生物的严重负面影响已被广泛接受。
　　 本论文主要以氨氧化菌群丰富的潮土为研究对象，以土壤潜在硝化速率(PNR)为氨氧化菌群的生态响应指标，研究潮土硝化作用对重金属的响应，同时利用超薄切片技术、透射电子显微镜(TEM)和能量扩散X射线光谱分析法(EDS)联用技术，分析不同种类和不同浓度重金属在欧洲亚硝化单胞菌细胞中的富集量及富集部位变化，主要研究结果如下：
　　 (1)在重金属Zn2+、Ni2+的处理下，PNR随着潮土中Zn2+、Ni2+处理浓度的增加而极显著地下降(P<0.01)，处理组与对照组均有差异(p<0.05)。潮土中Cd2+为低浓度(Cd2+浓度为1 mg·kg-1～10 mg·kg-1)时，潮土的PNR都较对照组显著升高(p<0.05)；当Cd2+浓度大于10 mg·kg-1，PNR随着潮土中Cd2+处理浓度的增加而极显著地降低(p<0.01)。潮土中Cu2+、Pb2+为低浓度(0 mg·kg-1～1500 mg·kg-1)时，潮土的PNR与对照组之间没有差异。当Cu2+、Pb2+为高浓度(浓度大于1500mg·kg-1)时，PNR随着潮土中Cu2+、Pb2+处理浓度的增加而显著地降低(p<0.05)。在Fe2+浓度(0 mg·kg-1～1500 mg·kg-1)、Hg2+(0 mg·kg-1～2000 mg·kg-1)、As2+(0mg.kg-1～20mg·kg-1)、Cr2+(0 mg·kg-1～600mg·kg-1)、Mn2+(0 mg.kg-1～3000mg·kg-1)处理范围内，土壤PNR与对照组之间没有显著差异。从EC50值上看，Pb(EC50)>Cu(EC50)>Ni(EC50)>Zn(EC50)>Cd(EC50)，对土壤PNR的抑制程度为：Pb　　 (2)虽然不同重金属处理下，菌体会因为培养条件的不同出现细微的差异，但是欧洲亚硝化单胞菌的形貌均呈现椭圆形，并且细胞表面光滑，细胞壁没有受到损害，细胞核区区分明显。空白对照组和重金属Zn的处理组，从超薄切片中看不出区别。但是重金属Ca2+处理组可以明显看出差异，即在细菌细胞体内存在黑色聚合物。并且经过EDX分析，对照组和重金属Zn2+和Cd2+之间的C元素含量没有差异，在重金属Zn2+处理组中没有发现Zn元素的存在，说明Zn元素没有进入到欧洲亚硝化单胞菌体内，或者菌体内含有的Zn的质量太少，没有检测到Zn元素的存在。但是，通过对Cd2+的能谱分析可以看出，黑色聚合物中含有了大量的Cd元素，这说明Cd2+可以在欧洲亚硝化单胞菌体内聚集，形成了80～100 nm的范围内大小的黑色图块，形成了非特异性的重金属复合物。
　　 (3)欧洲亚硝化单胞菌中含有16种氨基酸种类(天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸)。空白对照组和重金属处理组含有的氨基酸种类一致，但是他们的含量有差异。在重金属Cd2+(浓度为0.02g·L-1)的处理下，氨基酸天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、颉氨酸、酪氨酸比空白对照组明显增加(p<0.05)，但是当重金属Cd2+在溶液中的浓度达到0.04 g·L-1时，这些氨基酸的含量又随着重金属含量的增加而降低。但是另一些氨基酸如谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸随着重金属含量的增加而明显减低(p<0.01)。对于重金属Zn2+来说，氨基酸变化的趋势和重金属Cd处理是基本一致的。当使用低浓度Zn2+(0.05 g·L-1)处理时，氨基酸天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和亮氨酸比空白对照组明显增加(p<0.01)，但是当重金属Zn的浓度达到0.5 g·L-1时，这些氨基酸会随着重金属含量的增加而降低(p<0.01)。但是另外一些氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸随着重金属含量的增加而明显减低(p<0.01)。
　　 本研究探讨了氨氧化细菌对重金属的响应，筛选出氨氧化菌群敏感的重金属种类和浓度，并利用超薄切片技术、透射电子显微镜(TEM)和能量扩散X射线光谱分析法(EDS)联用技术，阐明了重金属Zn和Cd对欧洲亚硝化单胞菌在细胞水平上的影响机理。