模式识别受体激动剂poly(I:C)诱导胃癌细胞凋亡及逆转免疫耐受作用机制研究

摘要

研究目的:
　　 根据WHO统计，胃癌已经成为世界上第二常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲地区，严重危胁着人类健康。相比手术、放疗及化疗等传统的治疗方法，生物治疗被认为是一种有潜力的治疗方法。但是由于技术、费用等的限制，生物治疗在临床上应用仍有一定的困难。因此急需新的生物治疗手段和药物的研发，为胃癌的预防与治疗提供新的策略。
　　 越来越多的研究证实，模式识别受体(patternrecognitionreceptors，PRRs)不仅表达在免疫细胞中，在各种实质细胞，包括肿瘤细胞中也有广泛的表达，且表达谱各异，这就提示在非免疫细胞中PRR活化传递了不同于内源性免疫激活过程的分子事件。有关研究提示，这些PRR在肿瘤发生中的作用可能是把双刃剑，即在不同的肿瘤细胞和组织中，不同的PRR的激活可以产生完全不同的生物学效果，有的可以促进肿瘤细胞生存，有的则明显抑制肿瘤细胞存活。
　　 TLR3在细胞膜和内吞溶酶体均有表达，可识别dsRNA以及其类似物多聚次黄嘌呤多聚胞嘧啶核苷酸poly(I:C)，产生抗病毒反应。同时，表达在细胞内的胞浆RNA受体RLR也可以识别dsRNA和poly(I:C)，诱导Ⅰ型干扰素的产生。Poly(I:C)在肿瘤免疫治疗中的作用已被广泛论证。Poly(I:C)不仅能够作为免疫佐剂用于临床治疗，而且还可以直接诱导多种肿瘤的凋亡。然而，在胃癌细胞中，通过不同方式输送poly(I:C)对癌症发展进程的影响仍不清楚。本研究通过探索poly(I:C)对胃癌细胞的肿瘤行为影响，有助于了解激活肿瘤细胞PRR后的肿瘤生物学行为的更多分子细节，评价poly(I:C)用于胃癌生物治疗的可行性，为设计和利用基于PRR的抗肿瘤治疗药物提供有益的启示。
　　 研究方法:
　　 首先，以胃腺癌细胞系AGS和BGC-823细胞为模型，采用半定量RT-PCR检测TLR1-TLR10mRNA基础表达水平;MTT法、CCK-8法、EdU掺入法检测poly(I:C)对胃癌细胞的增殖能力的影响;MTT法、CFSE-7-AAD法评价NK细胞对poly(I:C)处理后的胃癌细胞杀伤能力的影响;实时定量PCR检测细胞因子mRNA水平的变化;流式细胞术检测TLR3、CyclinD1、MICA/B、ULBP2、CD54、Fas表达水平以及NKL细胞中CD107a、Perforin和TNF-α的分泌水平。
　　 然后，利用脂质体LipofectamineTM2000将poly(I:C)转染入胃癌细胞内，AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡;实时定量PCR法检测RLRs、Ⅰ型干扰素通路关键基因以及炎症因子的表达水平;siRNA分别沉默三种RLR受体;Western-blot检测NF-κB的活化;用干扰素受体阻断实验和外加干扰素实验检测Ⅰ型干扰素在poly(I:C)介导的细胞凋亡中的作用;分别用实时定量PCR和FACS检测凋亡相关分子Bcl-2家族基因mRNA和蛋白水平改变;构建pLMP-anti-Drosha质粒，检测沉默microRNA后，poly(I:C)对细胞凋亡的作用。通过建立BGC-823裸鼠肿瘤异种移植模型，观察poly(I:C)对肿瘤生长的抑制作用。
　　 最后，转染poly(I:C)后，MTT法检测NK细胞对胃癌细胞的杀伤能力以及流式细胞术分析胃癌细胞表面杀伤相关配体的表达水平。同时，用转染poly(I:C)后的肿瘤细胞上清孵育NK细胞，MTT法检测NK细胞的增殖、杀伤能力，Transwell实验检测迁移能力，流式细胞术分析脱颗粒能力、杀伤相关受体表达水平、以及促炎因子的分泌情况。
　　 实验结果:
　　 (1)胞外poly(I:C)可抑制胃癌细胞的增殖，这一过程的主要分子特征是DNA合成能力减弱、CyclinD1的表达水平降低，炎症因子mRNA的表达水平下降;同时，NK细胞对于poly(I:C)处理后的胃癌细胞的杀伤功能增强，NK细胞分泌CD107a、perforin、TNF-α的能力提高。
　　 (2)转染poly(I:C)后，体外观察到了明显的促胃癌细胞凋亡作用，且体内可以有效的抑制肿瘤的生长。这种促凋亡作用依赖于RLR的活化，但是不依赖于TLR3和PKR，并且Ⅰ型干扰素不参与直接的诱导凋亡效应。进一步研究发现Bcl-2家族也许在促凋亡过程中起作用。
　　 (3)Poly(I:C)处理后的胃癌细胞对于NK细胞的杀伤敏感性增强，同时伴随着NK细胞活化性受体NKG2D配体MICA/B和Fas的表达上调，NKG2A抑制性配体HLA-ABC的表达下调。对poly(I:C)处理后的胃癌细胞上清孵育NK细胞研究发现，NK细胞的增殖、迁移以及杀伤能力均有所增强，同时活化性受体及杀伤相关分子表达上调。进一步实验证实，NK细胞的活化依赖于poly(I:C)刺激后胃癌细胞产生的大量Ⅰ型干扰素。
　　 结论及意义:
　　 胞外poly(I:C)可直接抑制肿瘤的生长并提高胃癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性;胞内poly(I:C)不仅具有直接的促凋亡作用，而且可以通过改善肿瘤微环境增强天然免疫应答，逆转机体的免疫抑制状态。免疫刺激性RNA分子的合理应用，着眼于调动个体自身的抗肿瘤免疫应答而不是单纯的杀伤性药物，将直接细胞毒作用和高效免疫激活剂联合应用，是一种潜在的寻找有效治疗胃癌理想药物的思路。

目录

声明

摘要

主要符号说明

第一部分：文献综述

一、模式识别受体在天然免疫中的作用研究

参考文献

二、靶向模式识别受体的免疫佐剂抗肿瘤研究进展

参考文献

第二部分：模式识别受体激动剂poly(I：C)诱导胃癌细胞凋亡及逆转免疫耐受作用机制研究

1．前言

2．材料与方法

2．1 主要实验材料及试剂

2．2 主要试剂配制

2．3 主要仪器设备

2．4 主要实验方法

3．实验结果

3．1 胞外poly(I：C)对胃癌细胞生物学特征的影响

3．2 胞内poly(I：C)诱导胃癌细胞凋亡机制探讨

3．3 胞内poly(I：C)打破肿瘤免疫耐受

4．讨论和总结

参考文献

文章创新点及意义

致谢

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