溶酶体膜蛋白TMEM192在肝癌细胞HEPG2中的作用及其机制研究

摘要

肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上第5大常见癌症，占原发性肝癌的90％。在我国，HCC是最为常见的恶性肿瘤之一，其相关死亡率排名第二，仅次于肺癌。导致肝癌的高危环境因素主要是HBV和HCV病毒感染。在世界范围内因此原因而导致肝癌的占到肝癌发病总数80％之多。当然这其中还包括其他的病毒感染。近年来有研究报道，吸烟和酗酒也是肝癌的高危因素，并且在一些分子病中其患病的风险大大提升，比如血色素病，wilson病等。
　　 自噬是细胞的代谢方式之一，是指在饥饿条件下，细胞通过蛋白的降解，使细胞质中的物质和细胞器得以循环利用。有研究结果表明，自噬与肿瘤的发生发展密切相关，而自噬在肿瘤细胞中也起着或者促进细胞死亡或者维持细胞存活的作用。自噬是如何发挥这些作用的目前也还不清楚。本研究以新的溶酶体膜蛋白TMEM192为切入点，从基因层面研究其对肝癌细胞的状态、信号通路、标志物的影响，进一步推测其可能的作用机制。期待可以发现肝癌预防和治疗的新的突破点。
　　 第一部分，TMEM192生物信息学分析和内源性分布及亚细胞定位
　　 目的:
　　 在本部分，我们首先通过较全面的生物信息学分析来对TMEM192的氨基酸序列进行了分析，对它的结构进行预测，并在此基础上推测其可能具有的功能。并利用多种方法和证据进一步明确TMEM192是位于溶酶体的膜蛋白。同时对它的组织特异性分布进行研究。
　　 方法:
　　 1.应用可以连接国际互联网的电子计算机。从NCBI查获的人类TMEM192及鼠源Tmem192的全长氨基酸片段序列，并在专业的网站上对该基因进行结构预测分析。
　　 2.免疫荧光染色:为了证实TMEM192的亚细胞定位，分别利用溶酶体标志蛋白LAMP1(lysosomeassociatedmembraneprotein1)抗体，与特异性anti-TMEM192抗体对爬片细胞进行双染色标记。将单层爬片生长的细胞先于固定液中固定，接着孵育一抗，再孵育连接荧光的二抗，在荧光显微镜下观察结果。
　　 3.实时荧光定量PCR反应:在TRIzol提取总RNA后，将mRNA逆转录成cDNA，再用SYBRGreen(I)实时定量PCR方法检测各个组织TMEM192的组织分布情况，以及在各个细胞株的表达。扩增产物的特异性通过熔解曲线和凝胶电泳双重确认，采用2-△△ct法计算相对表达量。以上实验须重复三次。
　　 4.Westernboltting分析:提取组织内的蛋白后进行定量分析，然后经过电泳，转膜，以及免疫杂交，最后发光显影，进行结果分析。
　　 5.RT-PCR:检测各个组织及各细胞系的TMEM192表达情况。
　　 结果:
　　 1.TMEM192的生物信息学分析
　　 (1)通过查找TMEM192的基因序列并做生物的信息学分析，发现人类TMEM192基因定位于第4号染色体(165，997，256-166，034，071)，编码区全长4516碱基，含有6个外显子，编码271个氨基酸的蛋白质，分子量30KDa。其氨基酸序列如图1-1A所示。小鼠Tmem192基因定位于8号染色体(67，471，084-67，492，933)，编码区全长1123碱基，含有4个外显子，编码266个氨基酸序列的蛋白质，分子量约30KDa(图1-1B)。通过NCBI的BLAST比对工具比对发现人源和鼠源的蛋白质序列具有高度的一致性，相似性达95％。
　　 (2)由信号肽分析软件分析可知，该蛋白质存在信号肽的可能性较小。由在线软件分析可知(如下所示)，TMEM192的疏水性较强，最大值达到3.000，且位于N端最小值为-2.500(图1-4)。通常疏水性强的蛋白质常分布于内膜系统，胞内水溶性较低，提示具有较重要的生物学作用。
　　 (3)由分析结果得知，TMEM192含有6个蛋白激酶磷酸化位点，TMEM192至少存在2个N末端的糖基化位点。TMEM192至少存4个以上的跨膜螺旋序列(H表示)，这表明可能是膜上的受体或者定位于膜上。
　　 2.免疫荧光染色:绿色荧光显示的区域为TMEM192抗体标记。TMEM192显示为小点状绿色信号，分布于细胞浆内核周区域。膜上和核区域未见有绿色荧光信号。这表明TMEM192定位于细胞质中。与anti-LAMP1共染色(红色荧光部分)，我们发现TMEM192与LAMP1共定位特征，呈现双通道融合后的橘黄色信号特征。
　　 3.实时荧光定量PCR:为了研究TMEM192的组织分布特性，我们以小鼠的组织为研究对象，观察TMEM192在小鼠组织的表达特性。通过定量PCR分析表明TMEM192mRNA在小鼠心、肾、肝及胰腺组织有较高的表达。而在其它组织如皮肤、脾脏、脂肪、小肠等组织及器官，TMEM192的mRNA表达量相对较低或甚少。
　　 4.Wesrenblotting:用商业化的抗TMEM192多克隆抗体，我们通过对上述组织的蛋白提取物进行Westernblotting分析，得到了较好的结果，TMEM192蛋白在肝脏、心脏、肾脏等脏器及组织具有高丰度的表达，而在皮肤、睾丸及肺脏等器官和组织其蛋白质丰度相对较低或缺乏。
　　 5.RT-PCR:在观察TMEM192的组织学分布时我们也发现了TMEM192相对于正常细胞，在肿瘤细胞的高表达，我们利用普通RT-PCR技术，重复的观察到了这一结果。
　　 结论:
　　 (1)TMEM192存在于人类基因定位于第4号染色体的一个高度保守的基因，含有2个N末端的糖基化位点，6个蛋白激酶磷酸化位点，4个以上的跨膜螺旋序列的一个膜蛋白。
　　 (2)TMEM192是一个酶体膜蛋白，他和溶酶体标志蛋白LAMP1具有共定位特秆。
　　 (3)实时荧光定量PCR发现，TMEM192在小鼠心、肾、肝及胰腺组织有较高的表达。而在其它组织如皮肤、脾脏、脂肪、小肠等组织及器官，TMEM192的mRNA表达量相对较低或甚少。
　　 (4)Westernblotting分析发现TMEM192蛋白在肝脏、心脏、肾脏等脏器及组织具有高丰度的表达，而在皮肤、睾丸及肺脏等器官和组织其蛋白质丰度相对较低或缺乏。
　　 (5)TMEM192相对于正常细胞，在肿瘤细胞高表达。
　　 第二部分，TMEM192在肝癌细胞HepG2中的作用及其机制
　　 目的:
　　 在本部分研究中，我们进行了p-CMV-C-TMEM192-flag真核表达载体的构建，观察其在HepG2细胞中过表达对细胞生长和增殖的影响。同时利用RNA干扰技术把TMEM192-siRNA成功转染HepG2细胞后，达到沉默TMEM192的表达后，进而分析TMEM192缺失后对肿瘤细胞系和正常细胞系的影响。
　　 方法:
　　 (1)将TMEM192逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入真核表达载体pCMV-C-Flag，经酶切、PCR鉴定及测序分析，构建pCMV-C-TMEM192-Flag真核表达载体。
　　 (2)采用脂质体转染法，将质粒pCMV-C-TMEM192-FlagDNA转染HepG2细胞，荧光显微镜观察其表达。
　　 (3)在HepG2细胞中过表达后观察对其生长和增值的影响。
　　 (4)利用RNA干扰技术将针对人TMEM192基因设计的siRNA序列用阳离子脂质体介导转染HepG2细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞株。MTT法检测细胞活力，流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡，以及westernblot分析各相关基因的蛋白表达。
　　 (5)利用ATG7-siRNA诱导ATG7沉默后观察，在HepG2细胞阻断自噬途径是否能影响TMEM192-siRNA诱导的凋亡。进而推测TMEM192在这一过程中的可能的作用机制。
　　 结果:
　　 (1)重组真核表达载体pCMV-C-TMEM192-Flag已成功载入TMEM192的全长编码基因(除终止密码子外)，序列测定的结果与预期设计完全一致。外源性表达载体构建成功。
　　 (2)荧光显微镜下可见在转染pCMV-C-TMEM192-flag融合基因的HepG2细胞中存在荧光分布，转染成功。
　　 (3)在HepG2细胞中过表达TMEM192后，对于HepG2细胞的生长和增值并无显著的影响。
　　 (4)TMEM192-siRNA转染入HepG2细胞中，发现TMEM192基因表达沉默后，LC3的链接磷酸化被激活，同时Bax，caspase-3的表达升高，p38-MAPK磷酸化而激活。
　　 (5)在对HepG2细胞进行持续的TMEM192-siRNA干扰后，接着通过自吞噬的关键基因ATG7-siRNA处理细胞，沉默ATG7表达后发现能明显抑制在HepG2细胞的凋亡。并且在此过程中，我们也一并观察到Caspase-12、Bax及Caspase-3蛋白同时受到明显抑制。
　　 结论:
　　 (1)成功构建了真核表达载体pCMV-C-TMEM192-Flag。
　　 (2)pCMV-C-TMEM192-Flag转染HepG2细胞后，过表达TMEM192后对细胞并无显著的影响。
　　 (3)TMEM192-siRNA能有效地抑制TMEM192在HepG2细胞中的表达;而在HepG2细胞下调TMEM192能显著上调Bax，caspase-3，p38-MAPK的表达。
　　 (4)TMEM192可能是通过自噬途径来调控HepG2细胞的凋亡反应的。