KIR和HLA-C基因多态性与慢性乙肝的相关性及HBV转基因鼠单核细胞基因表达谱分析

摘要

第一部分，KIR和HLA-C基因多态性与慢性乙肝相关性的研究
　　 研究背景：
　　 慢性乙肝(CHB)是肝硬化和原发性肝癌的主要原因，世界上患有CHB的人数超过3.5亿，而且四分之三的CHB病人在中国。然而，CHB发生的原因至今尚不完全清楚。目前，宿主遗传因素受到重视，被认为是导致病毒持续存在的主要原因。由于宿主的免疫反应对病原体感染的结局起着关键的作用，因而许多研究都集中在免疫反应基因上。而且，免疫反应基因如人类白细胞抗原一类(HLA-Ⅰ)和二类(Ⅱ)基因在人类基因组中显示最高度的多态性，是研究其与乙肝病毒感染结局相关性的理想的候选基因。然而，以前研究报道的HLA多态位点和HBV感染临床结局间的相关性，在不同种族人群中的结果很不一致。因此，免疫反应中其它遗传因素可能在CHB的发生中发挥作用。
　　 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)基因具有多基因性和多态性，它们编码的分子主要表达在自然杀伤细胞(NK)和某些T细胞亚群上。NK细胞在先天性抗病毒感染免疫反应中发挥主要作用，部分是通过KIRs与表达在感染宿主细胞上它们的HLA-Ⅰ类配体的相互作用。与NK细胞上KIRs识别特别相关的是多态性的HLA-C分子。功能性KIR基因编码活化性和抑制性受体。迄今为止，已确定的人KIRs基因总共有17个，其中9个是NK细胞抑制性的(KIR2DL1-4，2DL5A，2DL5B，3DL1-3)，6个是活化性的(KIR2DS1-5，3DS1)，2个是假基因（KIR2DP1，3DP1）。另外，不同的KIR基因组合在一起形成可遗传的单体型。尽管这些单体型在包含基因的数量和种类上各不相同，然而，通常根据基因成分的不同，KIR单体型能被分成两个基本类别，即A类和B类。A类比B类简单，含有较多的抑制性基因，而B类单体型KIR基因的数目变化较大，其中更多的基因编码活化性KIR。至今，已公布的不同的B类单体型超过20种。现已明确，个体间含有不同数量的KIR抑制性和活化性基因。
　　 KIRs对HLA-C配体分子的识别依赖于HLA-C分子的结构基础。多态性的HLA-C等位基因根据HLA-C分子上80位的氨基酸是天冬酰胺(Asn80)还是赖氨酸(Lys80)表位，大体上可分成C1型和C2型。一些KIRs现已明确具有HLA-C识别特异性。KIR2DL1和KIR2DS1结合含有Lys80的HLA-C分子(HLA-C2)，而KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS2则识别含有Asn80的HLA-C分子(HLA-C1)。
　　 NK细胞的活性不但受抑制性受体，而且受活化性受体的调节，这些受体识别靶细胞上的HLA-C分子。因此，抑制信号和活化信号博弈的最终结果可能控制NK细胞杀伤胁迫细胞的能力。在体内，NK细胞在受体构成上处于抑制性受体的控制之下。因而，仅当活化信号的作用超越抑制信号时，NK细胞才能发挥效应功能。由于KIR和HLA基因的高度多态性以及它们各自独立的分布特点，加之KIR对特定HLA同种异型分子识别的特异性，个体间会出现各种不同的受体/配体组合谱型。这些HLA/KIR组合可能会相应地导致NK细胞活化阈值的差异。因此，人群中由这些遗传下来的多态性基因所决定的不同配体/受体组合可使效应细胞表现不同的功能，这能强烈影响个体对疾病的易感性。此前的几项研究表明，KIR受体/配体组合参与不同种类疾病的发生和发展。一项KIR2DL3和HLA-C1相互作用对丙型肝炎病毒(HCV)感染影响的研究显示，NK细胞的抑制性降低对HCV的感染具有保护作用。因此，在本研究中，我们假设KIR/HLA-C组合与CHB的发生可能也具有相关性。
　　 目的：
　　 通过比较等位基因、基因型、单体型以及KIR/HLA-C组合频率在CHB病例组与对照组中的分布，探讨多态性HLA-C、KIR基因和KIR/HLA-C基因组合与CHB的相关性。
　　 研究方法：
　　 研究对象:本研究依据CHB的诊断标准选择CHB患者182例（男性100例，女性82例），同时选择140例健康个体（男性75例，女性65例）作为对照。两组个体均来自于同一种族。所有个体没有HCV、丁型肝炎病毒以及HIV感染的血清学证据，也无其它如糖尿病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病。本研究经山东大学附属省立医院伦理委员会批准及参与者的知情同意。
　　 基因分型:通过序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)对HLA-C等位基因和KIR基因进行基因分型。采用DRB1的基因片段作为阳性对照，同时每一批扩增反应都包含阴性对照。对PCR-SSP基因分型标本的10％及少数不能确定结果的标本，结合KIR的HLA-C80位置处的特异性基序通过基因测序确证。除2DS5外，所有KIR基因位点都采用两套引物，以确保KIR基因分型的准确性。根据Witt等和Hsu等建立的模型确定KIR的基因型和单体型。
　　 统计学分析:Hardy-Weinberg遗传平衡的检验使用x2检验。病例组与对照组之间等位基因、基因型、单体型和KIR/HLA-C基因组合频率的比较采用x2检验，必要时使用Fisher确切概率检验。
　　 结果：
　　 1.在CHB病例组和对照组之间，HLA-C等位基因分布相似，各等位基因频率没有显著差异;而在CHB组中，HLA-C2等位基因的频率明显高于对照组(P=0.006)。
　　 2.在CHB病例组中，HLA-C1C1纯合基因型的频率明显低于对照组（P=0.01）。
　　 3.在CHB病例组和对照组之间，KIR基因、单体型和基因型的分布没有显著差异。
　　 4.在CHB病例组中，KIR2DL1与HLA-C2组合的频率明显高于对照组(P=0.013)。
　　 5.在CHB病例组中，KIR2DL3或KIR2DL3纯合型与HLA-C1C1组合的频率明显低于对照组（分别为P=0.011和P=0.024）。
　　 结论：
　　 1.抑制性受体KIR2DL1与HLA-C2配体的组合是CHB的易感因素。
　　 2.抑制性受体KIR2DL3或KIR2DL3纯合型与HLA-C1C1配体的组合是CIIB的保护性因素。
　　 第二部分，HBV转基因鼠单核细胞基因表达谱分析
　　 研究背景：
　　 乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科,是引起乙型病毒性肝炎的病原体。肝脏是HBV的主要复制器官,但HBV感染并不仅限于肝细胞,HBV感染也存在于骨髓和外周血单个核细胞。虽然在急、慢性乙肝患者外周血B细胞、单核细胞(Mo)、CD4+和CD8+T细胞和NK细胞均可检测到HBV的DNA和RNA,但Mo和B细胞的病毒载量和感染率明显高于其它淋巴细胞。
　　 近年来HBV感染和自身免疫性疾病关联性的研究取得较大进展。临床和实验研究显示,某些感染如HBV可能保护易感个体发生自身免疫性疾病(SLE和多发性硬化)。临床研究发现,慢性HBV感染合并SLE患者狼疮活动性、蛋白尿和抗dsDNA抗体滴度均明显低于非合并慢性乙肝(CHB)的SLE患者。以上发现提示HBV感染和SLE之间存在关联性,HBV感染可能对SLE的发生发展具有拮抗(保护)作用,但缺乏充分实验依据。我们在前期研究中以降植烷(pristane)诱导的狼疮鼠为模型,初步探讨了HBV感染是否对SLE具有保护作用及其可能的机制。我们的肾组织病理和血清学结果均显示HBV能减轻pristane诱导狼疮样小鼠的病理损伤,对SLE具有保护作用。根据既往研究报道和我们的前期研究发现,推测HBV感染对SLE可能保护作用的机制是：①抑制Mo异常活化和BAFF、TNF-α产生；②抑制B细胞活化和自身抗体分泌；③促进T细胞分泌IL-2和抑制其IL-17的产生 单核细胞作为固有免疫系统的主要组分,承担启动炎症、产生细胞因子、募集其它免疫细胞、吞噬和抗原呈递等多种免疫功能,它将先天性和固有免疫系统联系起来。近来的研究发现红斑狼疮患者的单核细胞／巨噬细胞有表面蛋白表达、细胞因子产生以及吞噬等功能的缺陷。单核细胞功能异常越来越被认为在各种自身免疫性疾病特别是SLE的发生发展中起重要作用。
　　 HBV感染可影响单核细胞的基因表达,鉴于单核细胞在SLE发生机制中的重要作用,单核细胞的功能改变可能影响SLE的发生及病理进程。几项HBV感染与SLE关系的研究结果提示,HBV感染可能通过改变单核细胞的功能来影响SLE的发生发展。然而,HBV感染对Mo基因表达谱的影响目前尚不清楚。在本研究中,我们应用HBV转基因鼠模型探讨HBV感染对单核细胞基因表达的影响。
　　 目的：
　　 通过对HBV转基因鼠和对照鼠脾单核细胞基因表达谱的比较,分析HBV感染单核细胞的差异表达基因；探索单核细胞免疫相关基因表达变化在SLE发生发展中的作用,为进一步阐明HBV感染与SLE的关系提供依据。
　　 研究方法：
　　 摘除雌性HBV转基因BALB/c小鼠与对照BALB/c小鼠的脾脏,制备脾单细胞悬液,分离单个核细胞。用磁分选法从脾单个核细胞中分离Mo。提取总RNA。在基因芯片分析系统上进行cRNA的合成、标记、芯片杂交,扫描、资料获取和分析。分析实验组与对照组各个探针位点荧光强度的比值(Ratio值)。Ratio值大于2.0时被认为有显著表达差异。
　　 结果：
　　 1.HBV转基因鼠与对照鼠相比,脾单核细胞转录表达有差异的基因共计125个,其中表达升高的有99个,表达降低的有26个。表达有差异的基因中与免疫相关的有10个,肿瘤相关的10个,信号通路相关的3个,细胞代谢相关的16个,离子通道相关的3个,细胞凋亡相关的2个,转录相关的5个,神经系统功能相关的8个,与某些疾病相关的有11个以及功能不明确的基因57个。
　　 2.与对照鼠相比,HBV转基因鼠脾单核细胞免疫相关的差异表达基因中,上调表达的有7个,下调表达的有3个。上调表达的基因包括几个免疫球蛋白结构域基因、干扰素诱导基因、C反应蛋白样基因(APC)以及Fas相关的基因(FADD);下调表达的基因包括G蛋白偶联受体基因、G蛋白信号传导调节因子基因以及趋化因子配体基因(CXCL2)。
　　 结论：
　　 1.HBV感染可改变单核细胞的基因表达谱。HBV感染单核细胞的差异表达基因参与免疫、信号转导和细胞代谢等多种功能。
　　 2.HBV感染单核细胞中免疫相关基因APC和FADD的上调表达以及CXCL2的下调表达,可降低自身免疫反应,减弱IFN-α的作用以及细胞介导的炎症反应,表明HBV感染可能通过改变这些基因在单核细胞内的表达对SLE起保护作用。