山东汉族人群NHL免疫相关遗传易感基因SNP分析及其功能研究

摘要

研究目的:非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)是一种发生于免疫系统的恶性肿瘤，也是目前世界上增长速度最快的恶性肿瘤，特别是近10年来增长速度显著增加。在美国每年大约66000例新增病例，18000例死亡病例;在中国，非霍奇金淋巴瘤发病率为3.5/10万，每年大约45000例新发病例，占恶性肿瘤发病第9位。流行病学研究表明，非霍奇金淋巴瘤具有家族聚集现象，近亲（尤其是兄弟姊妹或父母）中有血液/淋巴系统恶性疾病史者非霍奇金淋巴瘤发病风险可增加2～4倍，提示非霍奇金淋巴瘤的发病具有遗传易感性。同时研究也表明免疫功能失调是非霍奇金淋巴瘤的相关因素，提示免疫相关基因在非霍奇金淋巴瘤的发病中具有重要作用。因此，研究免疫相关基因的遗传变异背景对于阐明非霍奇金淋巴瘤的发病机制具有重要意义。本研究的主要内容包括以下三个部分:
　　(1)对2002年1月至2010年12月山东省肿瘤医院收治的1248例非霍奇金淋巴瘤患者进行临床及病理特征分析;
　　(2)研究免疫相关基因白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)、淋巴毒素(lymphotoxin，LTA)以及细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen4，CTLA-4)的12个SNP位点与山东汉族人群非霍奇金淋巴瘤易感性的关系;
　　(3)对与NK/T细胞淋巴瘤易感性密切相关的LTA+252A＞G位点的SNP的功能进行初步研究。
　　研究方法:
　　(1)2002年1月至2010年12月在山东省肿瘤防治研究院收治的具有连续性诊断为非霍奇金淋巴瘤的患者收集包括性别、年龄、病理类型及免疫组化、临床分期、病变部位、诊断日期、家族史、个人史、治疗方式等临床资料进行计数或计量资料进行统计分析;
　　(2)采用病例对照流行病学方法和候选基因法，对947例非霍奇金淋巴瘤患者和1044例相应健康对照抽取抗凝外周血，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(polymerase chain reaction-ligation detection reaction，PCR-LDR)技术对IL-10((-3575 T＞A，-1082A＞G，-819T＞C以及-592A＞C)、TNF-α(-857C＞T,-308G＞A以及-238G＞A)、 LTA(+252A＞G)和CTLA-4(-1661A＞G，-318C＞T,+49A＞G以及CT60A＞G)的12个SNP多态性位点进行基因分型检测，并采用logistic回归分析方法分析上述基因位点的多态性与非霍奇金淋巴瘤及其主要亚型（弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤）易感性的关系;
　　(3)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NK/T细胞淋巴瘤患者组和健康对照者组血浆LTA蛋白表达水平，并分析NK/T细胞淋巴瘤患者中携带不同LTA+252位点基因型与血浆LTA蛋白表达的关系，对LTA+252位点SNP的功能活性进行初步分析。
　　结果:
　　(1)1248例非霍奇金淋巴瘤患者临床及病理特征分析结果:①1248例非霍奇金淋巴瘤患者中，B细胞淋巴瘤807例(64.7％);T细胞淋巴瘤378例(30.3％)，非霍奇金淋巴瘤未分类者63例(5.0％)，比率最高的六种亚型分别为弥漫大B细胞淋巴瘤(40.9％)、NK/T细胞淋巴瘤(10.0％)、外周T细胞淋巴瘤(9.2％)、滤泡性淋巴瘤(6.4％)、粘膜相关结外边缘区B细胞淋巴瘤(5.4％)、前驱T淋巴母细胞淋巴瘤(4.5％);②从性别比率来看，B细胞淋巴瘤患者男女比为1.4∶1，T细胞淋巴瘤患者男女比为2.0∶1;③非霍奇金淋巴瘤平均年龄为47.7±16.3（18～85岁），B细胞淋巴瘤平均年龄为50.7±15.2岁，T细胞淋巴瘤平均年龄为42.0±17.0岁;发病年龄高峰呈单峰，为50～59岁年龄段;④从病变部位来看，淋巴结内发病比例约为64％，结外为36％，结外非霍奇金淋巴瘤最常见部位依次为消化系统、鼻腔和韦氏环。
　　(2)免疫相关基因IL-10、TNF-α、CTLA-4和LTA的12个SNP与非霍奇金淋巴瘤易感性关系研究结果:①对于总的非霍奇金淋巴瘤来说，未见上述基因多态性位点与总非霍奇金淋巴瘤的发病具有相关性。②将非霍奇金淋巴瘤分为B细胞性非霍奇金淋巴瘤和T细胞性非霍奇金淋巴瘤两大类时，TNF-α-857 TT基因型与B细胞性非霍奇金淋巴瘤的发病有关;IL-10-1082AG基因型和G等位基因、IL-10-819 CC基因型和C等位基因、LTA+252 AA基因型与T细胞性非霍奇金淋巴瘤的发病有关(P＜0.05)。③进一步对B细胞性和T细胞性非霍奇金淋巴瘤进一步亚型分析，IL-10-819CC基因型和C等位基因、IL-10-592CC基因型和C等位基因以及TNF-α-857TT基因型与滤泡性淋巴瘤发病有关(P＜0.05);IL-10-1082AG基因型和G等位基因、CTLA-4-1661 AG基因型和G等位基因、CTLA-4-318CT基因型和T等位基因、CTLA-4+49 G等位基因与外周T细胞淋巴瘤的发病有关(P＜0.05); LTA+252 AA基因型与NK/T细胞淋巴瘤的发病有关(P＜0.05)。
　　(3)与NK/T细胞淋巴瘤易感性密切相关的LTA+252位点SNP功能活性初步研究的结果显示，NK/T细胞淋巴瘤患者组血浆LTA水平明显高于健康对照组(P＜0.05);NK/T细胞淋巴瘤组中，LTA+252AA基因型者血浆蛋白表达水平较之GG基因型患者蛋白表达明显增高，差异有统计学意义(391.2±85.6pg/ml vs.197.3±31.5 pg/ml，P＜0.05)，LTA+252AG基因型者血浆蛋白表达亦有增高，差异具有临界性统计学意义(312.2±68.9pg/ml vs.197.3±31.5 pg/ml，P=0.06)。
　　结论:
　　(1)1248例非霍奇金淋巴瘤患者临床及病理特征分析结论:本研究表明山东汉族人群NHL的临床及病理分布与亚洲人群基本相似，但与西方国家有显著性差异，具有NK/T淋巴瘤比例显著增高的特点。总之，B细胞性淋巴瘤在全世界范围内均具有较高的比例，而中国T细胞淋巴瘤的比例较西方国家显著增高。DLBCL在全世界范围内均具有最高的发病率，占全部NHL的25％-50％。FL和CLL/SLL在西方国家显著高于中国，而T细胞淋巴瘤（特别是PTL、NK/T和T-LBL亚型）的发病率在西方国家显著低于中国。因此我国汉族人群非霍奇金淋巴瘤不仅在发病率上与欧美国家有显著性差异，同时在疾病分类的分布上亦存在明显的不同。我国汉族人群非霍奇金淋巴瘤具有自己独特的临床及病理特征。该研究为山东地区NHL流行病学研究提供重要参考价值。
　　(2)免疫相关基因IL-10、TNF-α、CTLA-4和LTA的12个SNP与非霍奇金淋巴瘤易感性关系研究结论:本研究提示存在于遗传背景上的免疫相关基因IL-10、TNF-α、LTA和CTLA-4的单核苷酸多态性可能与汉族人群非霍奇金淋巴瘤多种不同亚型的发病有关。其中，IL-10基因多态与滤泡性淋巴瘤的发病相关，IL-10和CTLA-4基因多态与外周T细胞淋巴瘤的发病相关，LTA基因多态与NK/T细胞淋巴瘤的发病具有一定相关。因此从免疫相关基因多态性与非霍奇金淋巴瘤易感性的关系研究为切入点，进行大样本病例-对照流行病学研究，极有可能发现非霍奇金淋巴瘤的致病关键基因并确定非霍奇金淋巴瘤的易感基因。
　　(3)与NK/T细胞淋巴瘤易感性密切相关的LTA+252位点SNP功能活性初步研究的结论:位于LTA+252位点的遗传基因变异可能通过影响其相应的细胞因子LTA蛋白水平的表达从而影响NK/T细胞淋巴瘤的发生。
　　意义:本研究首先对山东汉族1248例非霍奇金淋巴瘤患者的临床及病理特征进行分析，证实汉族人群非霍奇金淋巴瘤具有不同于西方的独特的临床及病理特征，同时在组建大规模的汉族人群非霍奇金淋巴瘤资源数据库基础上，采用PCR-LDR检测技术，对4个免疫相关基因的12个SNP位点进行分析，筛选并确定非霍奇金淋巴瘤及其主要亚型（弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤）的免疫相关易感基因，对筛选出的易感基因进行初步的功能分析，本研究为进一步在全基因组范围内进行全基因组关联分析筛查非霍奇金淋巴瘤易感基因、明确非霍奇金淋巴瘤的发病机制以及揭示各种族间发病差异奠定良好基础。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 非霍奇金淋巴瘤的临床病理特征分析

研究对象与方法

结果

讨论

小结

第二部分 IL-10、TNF-α、LTA、CTLA-4基因多态性与非霍奇金淋巴瘤易感性的关系

研究对象与方法

结果

讨论

小结

第三部分 NK／T细胞淋巴瘤患者LTA基因多态性与其血浆蛋白活性分析

研究对象与方法

结果

讨论

小结

结论

附录、附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文及成果

Appending paper 1 Pathological and clinical characteristics of 1，248 Non-Hodgkin’s lymphomas from a regional cancer hospital in Shandong，China

Appending paper 2 Polymorphisms in CTLA-4 and TNF／LTA and susceptibility to T--cell lymphoma in a Chinese population

学位论文评阅及答辩情况表