α2-肾上腺素受体激动剂对耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用及机制研究

摘要

第一部分α2-肾上腺素受体在大鼠耳蜗的分布表达研究
　　 研究目的:α2-肾上腺素受体(α2-adrenergicreceptors，α2-ARs)是肾上腺素受体(adrenergicreceptor，AR)家族的重要组成部分。尽管一些功能性方面的研究，如药理学实验，通过α2-ARs激动剂和拮抗剂间接证实了α2-ARs在耳蜗存在，但形态学方面直接观察α2-ARs在耳蜗分布表达状况的资料目前尚未见报道。了解α2-ARs在耳蜗分布表达特征，是进一步深入研究其在耳蜗发挥功能的基础。所以本实验主要从形态学角度观察α2-ARs在初生7天乳大鼠耳蜗的表达分布规律。
　　 实验方法:我们通过免疫组织化学染色来检测α2-ARs的三种亚型:α2a-，α2b-和α2c-AR在初生7天乳大鼠耳蜗的分布表达情况。为保证观察结果更具普遍性，染色的耳蜗切片至少来源自5只动物。α2a-和α2c-AR是多克隆抗体，α2b-AR是单克隆抗体。阳性对照选择肾脏组织。我们把在肾脏组织切片染色过程中，摸索出的作用效果较好的一抗浓度，参考应用到耳蜗组织切片的染色中。
　　 实验结果:我们发现α2-ARs在耳蜗的表达非常广泛:包括柯蒂氏器，螺旋神经节细胞(spiralganglionneurons，SGNs)，螺旋韧带和血管纹均见α2-ARs三种亚型阳性表达。在柯蒂氏器中，毛细胞，内、外沟细胞和Deiters’细胞等均存在三种亚型的表达，其中，毛细胞的顶部和底部，着色明显，并且表达强弱无太大差异。我们还发现，α2-ARs在不同亚型之间的细胞定位不同:α2a-AR主要定位在细胞核和核周部分，α2b-和2c-AR主要定位于细胞膜和核周部分。α2-ARs在耳蜗三转分布无明显强弱的变化。
　　 研究结论:α2-ARs在SGNs的表达，提示其可能影响SGNs的发育或功能。α2-ARs在柯蒂氏器广泛表达提示柯蒂氏器的支持细胞不仅为毛细胞提供机械支持，同时也可能为毛细胞提供代谢支持。α2-ARs表达在血管纹和螺旋韧带，提示α2-ARs可能参与调控特殊离子浓度梯度并调节内淋巴液的产生。α2-ARs在耳蜗的广泛表达为研究其在耳蜗的功能奠定了基础，α2-ARs可能在调节耳蜗功能方面发挥重要作用。
　　 第二部分溴莫尼定作用于α2-肾上腺素受体保护SGNs对抗谷氨酸和H2O2损伤的机制研究
　　 研究目的:溴莫尼定(brimonidine)，作为高度选择性α2-肾上腺素受体（α2-adrenergicreceptors，α2-ARs）激动剂，对某些神经细胞具有保护作用。大量实验结果证实，brimonidine可减轻谷氨酸诱导的神经兴奋性毒性，并降低由缺血所致的细胞外升高的谷氨酸浓度;另一方面，brimonidine可完全阻断活性氧簇的产生，减轻由H2O2诱导的细胞损伤，预防由氧化压力导致的细胞凋亡。而我们知道，耳蜗螺旋神经节细胞(spiralganglionneurons，SGNs)的兴奋性损伤和氧化损伤是许多类型感音神经性耳聋的基础。因此，我们假设brimonidine对受损的耳蜗SGNs也有保护作用。这种假设的前提条件是SGNs上有α2-ARs存在。但目前仍不明确SGNs上是否有α2-ARs表达，brimonidine是否对损伤的SGNs有保护作用也未见报道。所以本研究，拟明确α2-ARs在乳大鼠SGNs上的表达情况，并建立谷氨酸和H2O2损伤体外原代培养的SGNs模型，研究brimonidine对谷氨酸和H2O2损伤下的SGNs有无神经保护作用;如果有保护作用，我们将继续深入研究brimonidine保护神经的具体机制。这将为感音神经性耳聋提供可能的全新的治疗方法。
　　 实验方法:体外原代培养初生3天乳大鼠SGNs，采用抗-NSE抗体免疫荧光染色法鉴定SGNs后，通过RT-PCR，Westernblot和免疫荧光染色等方法，明确α2-ARs在SGNs上的表达，并定位α2-ARs在SGNs上表达部位。之后建立谷氨酸和H2O2损伤体外原代培养的SGNs模型，进一步观察在brimonidine干预或不干预的情况下，谷氨酸和H2O2作用于培养的SGNs的变化，通过MTT法分别检测各组细胞存活率。通过吖啶橙染色和Hoechst33342/PI双染色法观察各组细胞的凋亡和坏死情况。通过Westernblot法检测α2-ARs、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、p-ERK1/2、iNOS和artemin的表达变化，从而部分明确brimonidine保护SGNs的具体机制。
　　 实验结果:SGNs存在α2-ARs三亚型的表达。α2-ARs的mRNA表达的趋势与其蛋白表达趋势不平行，并且α2-ARs三亚型在SGNs细胞上的定位是明显不同的:α2a-受体主要存在于细胞核，细胞内的核周区域而α2b-和α2c-受体主要定位于核周部分和细胞膜。细胞存活率结果提示:在1mM谷氨酸或300μMH2O2作用下，SGNs细胞存活率明显降低。当给予谷氨酸干预细胞，培养24小时后，SGNs的细胞存活率相比于对照组降低至76.45±2.76％;当给予H2O2时，细胞存活率较空白对照组降低至62.84±5.16％，即300μM的H2O2所诱发的SGNs损伤比1mM谷氨酸引起的损伤严重。吖啶橙染色和Hoechst33342/PI双染均发现给予1mM谷氨酸或300μMH2O2后SGNs均出现明显的细胞质浓缩，染色质凝聚和凋亡小体等凋亡病理变化。Brimonidine可保护SGNs，减轻谷氨酸或H2O2所致的损伤，明显提高SGNs细胞存活率:当加入1μM的brimonidine后，谷氨酸组细胞存活率升高到92.97±3.43％(P＜0.001)，H2O2组细胞存活率提高到85.48±5.84％(P＜0.001)，统计学分析有显著差异。同时，brimonidine可降低由谷氨酸或H2O2诱发升高的Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-ERK1/2和artemin的蛋白表达水平(P＜0.005)，并改变Bcl-2和iNOS的表达(P＜0.005)。上述brimonidine所引起的这些变化和效果均可被育亨宾逆转(P＜0.05)。
　　 研究结论:我们的研究结果首次描述了α2-ARs在体外培养的大鼠SGNs上的表达情况;并且揭示了brimonidine可通过直接作用于α2-ARs，影响线粒体-Caspase依赖凋亡途径和p-ERK、iNOS通路等Caspase非依赖凋亡途径，减轻谷氨酸和H2O2所致的SGNs损伤。Brimonidine将有很大的可能性作为临床上预防和治疗感音神经性耳聋的潜在药物。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 α2-肾上腺素受体在大鼠耳蜗的分布表达研究

研究背景

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

第二部分 溴莫尼定作用于α2-肾上腺素受体保护SGNs对抗谷氨酸和H2O2损伤的机制研究

研究背景

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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