抗癫痫药物对癫痫幼鼠认知的影响及其机制的研究

摘要

研究背景：
　　 癫痫是临床常见的慢性神经系统疾病，以生后第一年发病率最高，部分患儿还伴有认知功能的损害，不仅危害了身心健康，还降低了整个家庭的生活质量。与癫痫相关的认知障碍一直是医生及家长非常关注的问题。癫痫患儿伴发的认知障碍与发病原因、起病年龄、病灶部位、发作类型、持续时间、发作频率及抗癫痫药物等多种因素均有关，但由于抗癫痫药物是可触及、可选择因素，且为目前治疗癫痫最主要方法而受到更多的关注。传统抗癫痫药物对认知功能的影响已有大量研究报道，发现对认知的多个方面包括空间学习记忆，运动水平，注意力甚至情绪等均可产生不良影响。虽然有一些研究显示新型抗癫痫药物较传统抗癫痫药物对认知功能的影响小，但研究并不充分，对发育期大脑影响的报道较少见，对托吡酯等药物到底是利是弊也存有争议。因此本研究中的抗癫痫药物既有存在争论的托吡酯(TPM)，也有近年临床普遍应用的其它新型抗癫痫药左乙拉西坦(LEV)、拉莫三嗪(LTG)和奥卡西平(OXC)，还包括目前仍广泛应用的传统抗癫痫药丙戊酸钠(VPA)，通过不同的测试方法评价这些药物对幼鼠空间学习记忆、工作记忆及活动水平的影响。
　　 抗癫痫药物对认知影响的具体机制至今尚不明了，使得临床上医生对于防治抗癫痫药物对认知的副作用无的放矢。以往已经进行了一些关于抗癫痫药物对大脑功能损害的研究，大多局限于对大脑细胞凋亡的影响，但是对其他可能的机制如对神经营养物质、神经元前体细胞增殖和迁移影响的研究很少，对突触结构及功能可塑性等方面的研究更是罕见，而这些也有可能是造成生前或生后接触抗癫痫药引起认知损害的重要原因，有必要对这些机制进行进一步的研究。
　　 目前的癫痫动物实验多使大鼠经历单次痫性发作持续状态，而临床上的癫痫患儿常有反复发作而非单次的长时程惊厥。数项研究也显示在未成熟动物中，单次的长时发作极少导致细胞丧失及发芽，也极少有学习记忆及行为缺陷，因此本实验以经历3次匹罗卡品诱发癫痫发作的新生期幼鼠为模型，并与正常大鼠进行对照研究，在模拟临床的同时观察抗癫痫药物是否对正常大鼠和癫痫大鼠有不同的影响。此前的实验多集中于成年期，对于发育期大脑的研究并不多，而小儿尤其是新生儿的神经生理及解剖与成人有很大不同，如突触产生及发育尚未完成，未成熟海马和皮层神经元对惊厥活动更易感，电惊厥传播异常，黑质惊厥抑制系统发育不足等，从而推测发育期的脑对抗癫痫药物的反应可能与成年期不同，之前也有研究显示抗癫痫药物对幼年动物认知功能的损伤大于成年动物。因此非常有必要深入研究长期应用抗癫痫药对发育期大脑认知功能的影响及其机制，对临床药物选择提供理论依据，实现有效控制癫痫发作同时降低对认知的影响。
　　 目的：
　　 研究长期应用抗癫痫药物对癫痫幼鼠的空间学习记忆、工作记忆、活动水平以及神经营养物质、神经发生、苔藓纤维发芽、突触可塑性相关蛋白的影响，探讨抗癫痫药物对发育期大脑认知功能的影响及其机制。
　　 方法：
　　 1.造模、分组及投药:
　　 选用出生后1d(P1)的雄性Wistar大鼠，随机分为癫痫组及对照组，癫痫组大鼠分别在生后1d，4d及7d予腹腔注射匹罗卡品诱发癫痫发作。对照组大鼠腹腔注射同等量生理盐水。将生后8d的存活的癫痫组大鼠随机分为生理盐水对照组(EP+NS)、VPA治疗组(EP+VPA)、LEV治疗组(EP+LEV)、OXC治疗组(EP+OXC)、TPM治疗组(EP+TPM)、LTG治疗组(EP+LTG);对照组大鼠随机分为生理盐水对照组(CON+NS)、应用VPA组(CON+VPA)、应用LEV组(CON+LEV)、应用OXC组(CON+OXC)、应用TPM组(CON+TPM)、应用LTG组(CON+LTG)。自生后8d，各药物干预组大鼠分别接受以下药物每日灌胃1次:VPA200mg/kg、LEV100mg/kg、TPM40mg/kg、OXC100mg/kg、LTG40mg/kg。生理盐水对照组每日接受生理盐水灌胃。连续用药3周。
　　 2.研究长期应用抗癫痫药物对幼鼠认知的影响:
　　 所有大鼠于P29-P30进行旷场测试以评价其活动水平，P31-P36时进行Morris水迷宫测试评价其视觉—空间学习和记忆能力，P37P-38进行改良的Y迷宫以评价其工作记忆。
　　 3.研究长期应用抗癫痫药物对发育期大脑神经营养物质、神经发生、苔藓纤维发芽及突触可塑性相关蛋白的影响:
　　 用药3周后，每组大鼠取6只断头取脑，测量脑重，用实时定量PCR检测脑源性神经营养因子(BDNF)和突触小体相关蛋白（SNAP-25）mRNA的表达，Westernblot检测BDNF、SNAP-25蛋白的表达。每组剩余的大鼠过量麻醉后分别灌注固定取脑行BrdU染色与Timm染色观察海马神经发生与苔藓纤维发芽。
　　 结果：
　　 1.长期应用抗癫痫药物对幼鼠认知的影响:
　　 (1)体重增长:VPA处理组大鼠用药4天后出现体重增长加快(P＜0.05)，LTG处理大鼠用药1周后体重增张减慢(P＜0.05)。TPM、LEV及OXC处理组大鼠体重增长与相应对照组无差异（P＞0.05）。
　　 (2)旷场实验:EP+NS组大鼠在固定时间内穿越的方格数明显低于CON+NS组大鼠（P＜0.01）。LEV处理组大鼠穿越的方格数较相应对照组增多（P＜0.05)。LTG处理组大鼠穿越的方格数较相应对照组减少（P＜0.05)。VPA、TPM及OXC处理大鼠穿越的方格数与相应盐水对照组无差异（P＞0.05）。
　　 (3)Morris水迷宫:EP+NS组大鼠较CON+NS组找到水下平台的时间明显延长，穿越原平台位置次数减少，在目的象限停留时间缩短（P＜0.05)。VPA处理组及CON+TPM组大鼠也较各自对照组找到平台的时间延长，穿越原平台位置的次数减少，在目的象限停留时间缩短(P＜0.05);EP+LEV组大鼠搜寻平台的潜伏期缩短，穿越原平台位置的次数增加，在目的象限停留时间延长(P＜0.05)。其余各组大鼠的成绩与相应对照组无差异(P＞0.05)
　　 (4)改良的Y迷宫:EP+NS组大鼠每天第一轮与第二轮测试中，每轮的后10次尝试，与前10次相比，错误次数无明显变化（P＞0.05），无论是训练阶段还是保持阶段，总错误次数均高于CON+NS组大鼠(P＜0.05)。EP+LEV组大鼠成绩优于EP+NS组，每日两轮测试中，每轮的后10次尝试与前10次相比错误次数明显减少(P＜0.05)。CON+TPM组大鼠的成绩落后于CON+NS组，每日每轮测试后10次尝试中的错误次数与前10次相比无统计学意义（P＞0.05）。其余各组大鼠的表现与相应对照无明显差异(P＞0.05)。
　　 2.长期应用抗癫痫药对BDNF、神经发生、苔藓纤维发芽及SNAP-25的影响。
　　 (1)脑重:EP+NS组大鼠脑重较CON+NS组降低约15％(P＜0.01)。VPA及TPM处理组大鼠脑重均较相应对照组降低（P＜0.05）。EP+LEV组大鼠脑重较EP+NS组增加(P＜0.01)。OXC、LTG处理组及CON+LEV组大鼠脑重与相应对照组无差异（P＞0.05）。
　　 (2)BDNF:EP+NS组大鼠海马中BDNFmRNA及蛋白表达均高于CON+NS组(P＜0.01)。VPA及TPM处理组大鼠海马中BDNFmRNA与蛋白的表达均较相应对照组降低（P＜0.05）。LEV及LTG处理组大鼠海马中BDNFmRNA与蛋白的表达较相应对照组增加(P＜0.05)。OXC处理组大鼠的表达与相应对照组无差异(P＞0.05)。
　　 (3)神经发生:EP+NS组大鼠海马齿状回、CA3区、门区和海马外区域中BrdU标记的细胞数较CON+NS组显著增加（P＜0.01)。EP+LEV组、EP+TPM组、EP+OXC组、EP+LTG组大鼠齿状回BrdU阳性细胞数均少于EP+NS组(P＜0.05);EP+VPA组大鼠齿状回BrdU阳性细胞数则较EP+NS组增多(P＜0.05)。对照组中所有用药组大鼠BrdU阳性细胞数与CON+NS组相比均无显著性差异(P＞0.05)。
　　 (4)苔藓纤维发芽:Timm染色结果显示EP+NS组大鼠海马CA3区及颗粒上层的Timm记分均高于CON+NS组(P＜0.05)。但所有药物处理组大鼠CA3区及颗粒上层的Timm记分与相应生理盐水对照组相比均无统计学意义(P＞0.05)。
　　 (5)SNAP-25:EP+NS组大鼠海马中SNAP-25mRNA及蛋白的表达低于CON+NS组(P＜0.01)。VPA处理组大鼠SNAP-25mRNA及蛋白的表达也较相应对照组降低(P＜0.05)。LEV、TPM、OXC及LTG处理组与相应对照组的NAP-25mRNA及蛋白表达无差异。(P＞0.05）
　　 结论：
　　 1.不同的抗癫痫药物对认知的影响不同
　　 (1)VPA损害了癫痫幼鼠及正常幼鼠的空间学习记忆能力，但对工作记忆及活动水平无不良影响;VPA还可使体重增长加快。
　　 (2)LEV改善了癫痫幼鼠的空间学习记忆及工作记忆，但对正常幼鼠的认知无影响;LEV还增加了癫痫幼鼠及正常幼鼠活动水平，但对体重增长无影响。
　　 (3)TPM对正常幼鼠的空间学习记忆能力及工作记忆有不良影响，但未加重癫痫幼鼠的认知损害，且不影响发育期幼鼠的活动水平及体重增长。
　　 (4)LTG对癫痫幼鼠及正常幼鼠的空间学习记忆、工作记忆无不良影响、但可致体重增长减慢及活动水平降低。
　　 (5)OXC对癫痫幼鼠及正常幼鼠的空间学习记忆、工作记忆、活动水平及体重增长均无不良影响。
　　 2.不同抗癫痫药物对认知影响的机制不同。
　　 (1)VPA可致癫痫幼鼠及正常幼鼠的脑重降低，海马中BDNF及SNAP-25的表达减少，只增强癫痫幼鼠的神经发生，不影响正常幼鼠的神经发生及所有大鼠的苔藓纤维。
　　 (2)LEV可致癫痫大鼠及正常大鼠海马中BDNF表达均增高，只使癫痫幼鼠脑重增加及神经发生降低，不影响正常大鼠的脑重、神经发生、以及所有大鼠的苔藓纤维和海马中SNAP-25的表达。
　　 (3)TPM可使癫痫幼鼠及正常幼鼠的脑重降低，海马中BDNF的表达减少，只减少癫痫幼鼠神经发生，对正常幼鼠的神经发生及所有大鼠的苔藓纤维及SNAP-25的表达无影响。
　　 (4)LTG可使癫痫幼鼠及正常幼鼠海马中BDNF的表达增高，只减少癫痫幼鼠神经发生，对正常幼鼠的神经发生及所有大鼠的脑重、SNAP-25的表达及苔藓纤维均无影响。
　　 (5)OXC可减少癫痫幼鼠的神经发生，对正常幼鼠的神经发生及所有幼鼠的脑重、海马中BDNF与SNAP-25表达及苔藓纤维均无影响。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 长期应用抗癫痫药物对癫痫幼鼠认知的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 长期应用抗癫痫药物对癫痫幼鼠大脑神经营养物质、神经发生、苔藓纤维发芽及突触可塑性相关蛋白的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

学位论文评阅及答辩情况表

附：英语论文一

附：英语论文二