Notch-1信号通路和microRNAs在天然植物药物抗骨肉瘤中的作用及机制研究

摘要

第一部分天然植物药物姜黄素和大蒜素对骨肉瘤细胞生物学行为的影响
　　 研究背景:
　　 骨肉瘤(osteosarcoma)是一种以血管侵犯、局部软组织浸润为主要特征的骨科常见原发性恶性骨肿瘤，主要发生于儿童和青少年，具有早期远处转移和高度局部复发倾向。新辅助化疗联合外科治疗作为骨肉瘤治疗的主要手段已取得较大进展，但仍有大部分患者临床预后较差，5年生存率仅20％，其主要原因之一是远处转移和耐药复发。尽管临床已开发出多种针对骨肉瘤转移和耐药复发的药物，但临床疗效仍不满意，且毒副作用很大。因此，亟待寻找一种安全、有效的新药能够延缓骨肉瘤进展，提高骨肉瘤患者生存。
　　 姜黄素(curcumin)是一种从姜科植物姜黄的根茎中提取的酚类色素，能够影响细胞增殖、周期、凋亡和侵袭转移等多种生物学行为，在结肠癌、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌等多种肿瘤中发挥抗癌作用。研究显示，姜黄素可下调胰腺癌细胞中周期蛋白cyclin D1和凋亡相关分子Bcl-XL的表达，诱导细胞周期阻滞和凋亡增加，从而抑制胰腺癌细胞增殖。有研究报道，姜黄素亦可减弱基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达和活性，导致结肠癌细胞侵袭转移及血管新生抑制。
　　 大蒜素(DATS)是一种从百合科植物大蒜的鳞茎中提取的有机硫化合物。研究发现，大蒜素可以降低心血管疾病和糖尿病的发病风险，提高免疫力，发挥抗感染、抗衰老及抗肿瘤等作用。有研究报道，大蒜素能使前列腺癌细胞中周期蛋白cyclin B1和凋亡相关分子Bcl-2、caspase-3的表达减少，诱导细胞G2/M期阻滞、促进凋亡，从而导致前列腺癌细胞增殖能力减弱。大蒜素亦可通过降低MMP-2、-7、-9的表达和活性，抑制结肠癌细胞侵袭转移。另有研究显示，大蒜素可诱导血管内皮细胞体外血管新生抑制，其机制可能与VEGF的表达下调有关。由此可见，大蒜素可抑制多种肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和血管新生，从而发挥抗肿瘤作用。我们前期研究发现大蒜素能够诱导骨肉瘤SaOS-2细胞G0/G1期阻滞、凋亡增加，且骨肉瘤细胞增殖能力降低，提示大蒜素可能亦能发挥抗骨肉瘤作用。
　　 综上所述，天然植物药物姜黄素和大蒜素可调控细胞增殖、周期、凋亡、侵袭转移和血管新生，在多种肿瘤中发挥抑制作用，但其对骨肉瘤的作用目前尚不明确。本研究拟观测天然植物药物姜黄素和大蒜素对骨肉瘤细胞生物学行为的影响，为骨肉瘤的治疗提供新思路。
　　 研究目的:
　　 研究姜黄素和大蒜素对骨肉瘤细胞增殖、周期、迁移、侵袭及HUVECs体外血管新生等生物学行为的影响，以期为抗骨肉瘤治疗提供新策略。
　　 研究方法:
　　 1.细胞增殖实验:骨肉瘤细胞种板，加入不同浓度姜黄素或大蒜素孵育24、48、72h，应用MTT法检测骨肉瘤细胞的存活，评价天然植物药物对骨肉瘤细胞增殖的影响。
　　 2.流式细胞实验(FCM):骨肉瘤细胞种板，加入不同浓度姜黄素或大蒜素孵育48h，碘化丙啶(PI)染色，应用流式细胞术检测骨肉瘤细胞的周期，评价天然植物药物对骨肉瘤细胞周期的影响。
　　 3.细胞划痕实验:骨肉瘤细胞种板，融合率达90％时，用枪头进行划痕，加入一定浓度大蒜素孵育24、36h，应用划痕实验检测骨肉瘤细胞的迁移，评价天然植物药物对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。
　　 4.细胞侵袭实验:骨肉瘤细胞种板，加入不同浓度姜黄素或大蒜素孵育24h，将存活的骨肉瘤细胞种入已铺好Matrigel基质胶的Tranwell小室上层，行无血清培养48h，应用侵袭实验检测骨肉瘤细胞的侵袭，评价天然植物药物对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。
　　 5.HUVECs体外血管新生实验:骨肉瘤细胞种板，加入一定浓度大蒜素无血清培养24h，离心取上清，即为条件培养基;将HUVECs细胞种入已铺好Matrigel基质胶的24孔板，加入条件培养基培养8h，应用HUVECs体外血管新生实验检测骨肉瘤细胞上清诱导的HUVECs细胞管状形成，评价天然植物药物对骨肉瘤细胞体外血管新生能力的影响。
　　 研究结果:
　　 1.姜黄素、大蒜素抑制骨肉瘤细胞增殖:将U2OS、SaOS-2和MG-63细胞接种于96孔板，加入梯度浓度的姜黄素(7.5、15、22.5、30、37.5μM)和大蒜素(25、50、100μM)孵育24、48、72h。MTT结果显示姜黄素和大蒜素可明显抑制U2OS、SaOS-2和MG-63细胞的增殖，且其增殖抑制作用具有剂量、时间依赖性。
　　 2.姜黄素、大蒜素诱导骨肉瘤细胞G2/M期、G0/G1期阻滞:将U2OS、SaOS-2和MG-63细胞接种于6孔板，加入姜黄素（15μM）和大蒜素（25、50μM）孵育48h，PI染色。FCM结果显示姜黄素和大蒜素可分别使U2OS、SaOS-2和MG-63细胞周期阻滞于G2/M期、G0/G1期，且其周期阻滞作用具有剂量依赖性。
　　 3.大蒜素抑制骨肉瘤细胞迁移:将U2OS、SaOS-2和MG-63细胞接种于6孔板，待细胞融合率达90％，用枪头划板，加入大蒜素(25μM)孵育24、36h。划痕实验结果显示大蒜素可明显抑制U2OS、SaOS-2和MG-63细胞的迁移，且其迁移抑制作用具有时间依赖性。
　　 4.姜黄素、大蒜素抑制骨肉瘤细胞侵袭:将U2OS、SaOS-2和MG-63细胞接种于6孔板，加入梯度浓度的姜黄素（7.5、15、22.5μM）和大蒜素(25、50、100μM)孵育24h，存活的细胞行Tranwell无血清培养48h。侵袭实验结果显示姜黄素和大蒜素抑制可明显抑制U2OS、SaOS-2和MG-63细胞的侵袭，且其侵袭抑制作用具有剂量依赖性。
　　 5.大蒜素抑制骨肉瘤细胞体外血管新生:将U2OS、SaOS-2和MG-63细胞接种于6孔板，加入大蒜素(25μM)孵育，行无血清培养24h，获得条件培养基，条件培养基培养HUVECs细胞8h。HUVECs体外血管新生实验结果显示U2OS、SaOS-2和MG-63细胞培养上清可明显促进HUVECs细胞管状形成，而大蒜素可显著抑制U2OS、SaOS-2和MG-63细胞的体外血管新生。
　　 结论:
　　 1.姜黄素能够诱导骨肉瘤细胞G2/M期阻滞，抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭。
　　 2.大蒜素能够诱导骨肉瘤细胞G0/G1期阻滞，抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和体外血管新生。
　　 3.天然植物药物姜黄素和大蒜素能够抑制骨肉瘤的发生、发展，有望成为抗骨肉瘤治疗的新选择。
　　 第二部分Notch-1信号通路在姜黄素和大蒜素抗骨肉瘤中的作用及机制研究
　　 研究背景:
　　 Notch-1信号通路在细胞增殖、凋亡和分化等命运决定中起重要作用，其异常表达与多种肿瘤的发生、发展关系密切。研究显示，Notch-1分子在胰腺癌、宫颈癌、结肠癌以及骨肉瘤等多种实体肿瘤中高表达。有研究报道，Notch-1信号通路在骨肉瘤细胞的侵袭转移中亦发挥关键作用，抑制骨肉瘤细胞中Notch-1信号通路可明显减弱其侵袭转移能力，阻止骨肉瘤进展。因此，靶向Notch-1信号通路可能成为抗骨肉瘤治疗的有效手段。
　　 我们前期研究显示，天然植物药物姜黄素和大蒜素可抑制骨肉瘤U2OS、SaOS-2、MG-63细胞的增殖、迁移、侵袭和体外血管新生，从而发挥抗骨肉瘤作用。然而，姜黄素和大蒜素在骨肉瘤中的作用机制目前尚不清楚，是否Notch-1信号通路参与其抗骨肉瘤作用仍有待进一步探讨。
　　 研究报道，姜黄素可抑制胰腺癌细胞中Notch-1信号通路，诱导细胞周期阻滞、凋亡增加，从而抑制胰腺癌细胞增殖。我们前期研究亦发现姜黄素、大蒜素作用于骨肉瘤SaOS-2细胞后，Notch-1的mRNA和蛋白表达水平明显降低，提示姜黄素和大蒜素的抗骨肉瘤作用可能与骨肉瘤细胞中Notch-1信号通路的抑制有关。
　　 另有研究显示，基质金属蛋白酶(MMPs)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)是肿瘤侵袭、转移及血管新生的关键分子，其与Notch-1信号存在交互作用。有研究报道，下调胰腺癌中Notch-1的表达可降低MMPs和VEGF的表达和活性，导致胰腺癌的侵袭、转移和血管新生能力减弱。因此，我们推测Notch-1信号通路与MMPs或VEGF在骨肉瘤细胞的侵袭、转移及血管新生中很可能存在交互作用。
　　 本研究在前期工作基础上进一步探讨天然植物药物姜黄素和大蒜素的抗骨肉瘤作用机制，为骨肉瘤的治疗提供新靶点。
　　 研究目的:
　　 明确骨肉瘤细胞中姜黄素和大蒜素与Notch-1信号通路和MMPs、VEGF的关系，阐明姜黄素和大蒜素发挥抗骨肉瘤作用的具体机制，以期为抗骨肉瘤的分子靶向治疗提供理论学依据和实验室基础。
　　 研究方法:
　　 1.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)实验:收集不同浓度姜黄素或大蒜素孵育的骨肉瘤细胞，采用TRIzol提取细胞总RNA，使用M-MuLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，应用Real-time RT-PCR方法检测天然植物药物孵育前、后骨肉瘤细胞中Notch-1、Hes-1、Hey-1、Hey-2、MMP-2、MMP-9和VEGF基因mRNA表达的变化。
　　 2.Western blot实验:收集不同浓度姜黄素或大蒜素孵育的骨肉瘤细胞，采用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白，SDS-PAGE胶进行凝胶电泳，应用Westernblot方法检测天然植物药物孵育前、后骨肉瘤细胞中Notch-1、Hes-1、cyclinD1、MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达的变化。
　　 3.明胶酶谱实验:收集不同浓度姜黄素或大蒜素孵育的骨肉瘤细胞上清，BCA试剂盒检测上清的蛋白浓度，取等量蛋白上样，采用含A型明胶的SDS-PAGE胶进行凝胶电泳，应用明胶酶谱法检测天然植物药物孵育前、后骨肉瘤细胞上清中MMP-2和MMP-9活性的改变。
　　 4.酶联免疫吸附实验(ELISA):收集不同浓度姜黄素或大蒜素孵育的骨肉瘤细胞上清，应用ELISA法检测天然植物药物孵育前、后骨肉瘤细胞上清中VEGF活性的改变。
　　 5.细胞转染实验:应用LipofectamineTM2000将携带Notch-1胞内段(ICN)真核表达载体(pMSCV-ICN)的质粒或Notch-1小干扰片段(siRNA)分别转染骨肉瘤细胞，并用G418筛选至少2周。应用western blot方法检测转染前、后骨肉瘤细胞中Notch-1、Hes-1、cyclin D1、MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达的变化;应用明胶酶谱法检测转染前、后骨肉瘤细胞上清中MMP-2和MMP-9活性的改变;应用ELISA法检测转染前、后骨肉瘤细胞上清中VEGF活性的改变。
　　 6.细胞增殖实验:转染前、后骨肉瘤细胞种板，加入一定浓度姜黄素或大蒜素孵育48h，应用MTT法检测转染对骨肉瘤细胞增殖的影响。
　　 7.细胞侵袭实验:转染前、后骨肉瘤细胞种板，加入一定浓度姜黄素或大蒜素孵育24h，将存活的骨肉瘤细胞种入已铺好Matrigel基质胶的Tranwell小室上室，行无血清培养48h，应用侵袭实验检测转染对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。
　　 8.HUVECs体外血管新生实验:转染前、后骨肉瘤细胞种板，加入一定浓度大蒜素无血清培养24h，离心取上清，即为条件培养基;将HUVECs细胞种入已铺好Matrigel基质胶的24孔板，加入条件培养基培养8h，应用HUVECs细胞管状形成实验检测转染对骨肉瘤细胞体外血管新生能力的影响。
　　 研究结果:
　　 1.姜黄素、大蒜素抑制骨肉瘤细胞中Notch-1信号通路和MMPs、VEGF的表达及活性:
　　 1.1 Real-time RT-PCR结果显示，姜黄素(7.5、15、22.5μM)可减弱U2OS和MG-63细胞中Notch-1、Hes-1、Hey-1、Hey-2、MMP-2和MMP-9基因mRNA表达，大蒜素（50μM）可降低U2OS、SaOS-2和MG-63细胞中Notch-1、Hes-1、Hey-1、Hey-2、MMP-2、MMP-9和VEGF基因mRNA表达。
　　 1.2 Western blot结果显示，姜黄素(7.5、15、22.5μM)可抑制U2OS和MG-63细胞中Notch-1、Hes-1、cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表达，大蒜素(25、50μM)可下调U2OS、SaOS-2和MG-63细胞中Notch-1、Hes-1、cyclin D1、MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达。
　　 1.3明胶酶谱结果显示，姜黄素(7.5、15、22.5μM)可减弱U2OS和MG-63细胞上清中MMP-2和MMP-9活性，大蒜素（50μM）可降低U2OS、SaOS-2和MG-63细胞上清中MMP-2和MMP-9活性。
　　 1.4 ELISA结果显示，大蒜素（25、50μM）可减弱U2OS、SaOS-2和MG-63细胞中VEGF分泌。
　　 2.上调Notch-1减弱姜黄素、大蒜素的抗骨肉瘤作用:
　　 2.1 Western blot结果显示，pMSCV-ICN表达载体稳定转染后，U2OS细胞中Notch-1的蛋白表达较对照组明显升高，说明Notch-1真核表达载体能有效上调U2OS细胞中Notch-1的表达。上调Notch-1亦可明显增加U2OS细胞中Hes-1的蛋白表达。
　　 2.2 MTT结果显示，pMSCV-ICN表达载体稳定转染后，U2OS细胞增殖能力较对照组明显提高，且上调Notch-1可减弱姜黄素和大蒜素对U2OS细胞增殖的抑制作用。
　　 2.3侵袭实验结果显示，pMSCV-ICN表达载体稳定转染后，U2OS细胞侵袭能力较对照组明显增强，且上调Notch-1可降低姜黄素和大蒜素对U2OS细胞侵袭的抑制作用。
　　 2.4明胶酶谱结果显示，pMSCV-ICN表达载体稳定转染后，U2OS细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性较对照组明显升高，且上调Notch-1可中和姜黄素对U2OS细胞上清中MMP-2和MMP-9活性的抑制作用。
　　 3.下调Notch-1增强姜黄素、大蒜素的抗骨肉瘤作用:
　　 3.1 Western blot结果显示，Notch-1 siRNA转染后，U2OS细胞中Notch-1的蛋白表达较对照组明显降低，说明针对Notch-1的siRNA片段能有效下调U2OS细胞中Notch-1的表达。下调Notch-1亦可明显减少U2OS细胞中Hes-1、cyclinD1、MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表达。
　　 3.2 MTT结果显示，Notch-1 siRNA转染后，U2OS细胞增殖能力较对照组明显减弱，且下调Notch-1可增强姜黄素和大蒜素对U2OS细胞增殖的抑制作用。
　　 3.3侵袭实验结果显示，Notch-l siRNA转染后，U2OS细胞侵袭能力较对照组明显减弱，且下调Notch-1可增强姜黄素和大蒜素对U2OS细胞侵袭的抑制作用。
　　 3.4明胶酶谱结果显示，Notch-1 siRNA转染后，U2OS细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性较对照组明显减低，且下调Notch-1可增加姜黄素和大蒜素对U2OS细胞上清中MMP-2和MMP-9活性的抑制作用。
　　 3.5 HUVECs体外血管新生实验结果显示，Notch-1 siRNA转染后，U2OS细胞上清诱导HUVECs细胞管状形成较对照组明显减少，且下调Notch-1可增强大蒜素对U2OS细胞体外血管新生的抑制作用。
　　 3.6 ELISA结果显示，Notch-1 siRNA转染后，U2OS细胞上清中VEGF的分泌较对照组明显减少，且下调Notch-1可增加大蒜素对U2OS细胞上清中VEGF分泌的抑制作用。
　　 结论:
　　 1.姜黄素可通过抑制Notch-1信号通路和MMPs的表达及活性，减弱骨肉瘤细胞的增殖、侵袭能力，从而发挥抗骨肉瘤作用。
　　 2.大蒜素可通过抑制Notch-1信号通路和MMPs、VEGF的表达及活性，减弱骨肉瘤细胞的增殖、迁移侵袭和血管新生能力，从而发挥抗骨肉瘤作用。
　　 第三部分microRNAs调控Notch-1信号通路在大蒜素抗骨肉瘤中的作用及机制研究
　　 研究背景:
　　 近期研究发现，一类小分子--microRNA（miRNA）参与细胞增殖、侵袭转移、血管新生等多种生物学进程，在骨肉瘤发生、进展中发挥重要的作用。我们前期研究提示，天然植物药物大蒜素能够抑制骨肉瘤细胞生长和侵袭，推测其抗骨肉瘤作用还可能与miRNA的调节有关。
　　 miRNA是近年来发现的一类高度保守的内源性单链非编码小分子RNA，通过在转录或转录后水平调控基因表达，广泛参与各种细胞进程。成熟miRNA能与靶基因mRNA的3'非翻译区(UTR)结合，引起靶基因mRNA的降解和/或翻译抑制，从而下调靶基因蛋白的表达。
　　 研究显示，miRNA在骨肉瘤等多种实体肿瘤中存在表达失调，其异常表达与肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭转移密切相关。有研究报道，miR-21在骨肉瘤中表达显著升高，降低miR-21表达可增强肿瘤抑制因子RECK的表达，明显减弱骨肉瘤细胞的迁移、侵袭能力。另有研究显示，miR-34a在骨肉瘤中呈低表达，miR-34a过表达可靶向下调c-Met，从而显著抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移。此外，骨肉瘤细胞中miR-143/145亦表达下调，且其低表达与骨肉瘤肺转移程度有关，上调miR-143/145能够分别抑制其靶基因MMP-13和VEGF的表达，使骨肉瘤细胞的侵袭和血管新生能力明显减弱。由此可见，不同的miRNA分子可能因其靶基因不同，作用各异，具有原癌基因或抑癌基因的功能，在骨肉瘤的发病及进展中起重要作用。
　　 新近研究表明，miRNA与Notch-1信号通路在肿瘤的发生、发展中存在交互作用。有研究报道，髓母细胞瘤中miR-34a可调控Notch-1信号通路和抑癌基因P53的表达，从而影响髓母细胞瘤细胞的增殖、分化、侵袭转移。我们前期研究亦发现，大蒜素作用于骨肉瘤SaOS-2细胞后，Notch-1表达下调的同时伴有miR-34a的表达上调。因此，我们推测microRNAs可能调控Notch-1信号通路，在大蒜素抗骨肉瘤中起一定作用。
　　 本研究在前期工作基础上进一步研究骨肉瘤细胞中大蒜素与miRNAs分子的关系，探讨miRNAs和Notch-1信号通路在大蒜素抗骨肉瘤中的交互作用，为骨肉瘤的治疗提供新策略。
　　 研究目的:
　　 明确在骨肉瘤中可能调控Notch-1信号通路的miRNAs分子，探讨miR-34a、miR-200b在大蒜素抗骨肉瘤中对Notch-1表达的调控作用，阐明其作用机制，为抗骨肉瘤的分子靶向治疗提供新靶点。
　　 研究方法:
　　 1.miRNA Real-time RT-PCR实验:收集一定浓度大蒜素孵育的骨肉瘤细胞，采用TRIzol提取细胞总RNA，使用All-in-One miRNA检测试剂盒将RNA逆转录为cDNA，应用miRNA Real-time RT-PCR方法检测大蒜素孵育前、后骨肉瘤细胞中miR-34a、miR-143、miR-145、miR-200b，c和miR-21表达的变化。
　　 2.Notch-1 siRNA细胞转染实验:应用LipofectamineTM2000将Notch-1 siRNA及阴性对照siRNA转染骨肉瘤细胞，72h后收集细胞。应用miRNA Real-timeRT-PCR方法检测转染前、后骨肉瘤细胞中miR-34a、miR-143、miR-145、miR-200b，c和miR-21表达的变化。
　　 3.Mimics细胞转染实验:应用LipofectamineTM2000将miR-34a或miR-200bmimics及阴性对照mimics转染骨肉瘤细胞，72h后收集细胞。应用miRNAReal-time RT-PCR方法检测转染前、后骨肉瘤细胞中miR-34a和miR-200b表达的变化。
　　 4.Westem blot实验:收集miR-34a或miR-200b mimics转染的骨肉瘤细胞，采用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白，SDS-PAGE胶进行凝胶电泳，应用Westem blot方法检测转染前、后骨肉瘤细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达的变化。
　　 5.明胶酶谱实验:收集miR-34a或miR-200b mimics转染的骨肉瘤细胞，BCA试剂盒检测上清的蛋白浓度，取等量蛋白上样，采用含A型明胶的SDS-PAGE胶进行凝胶电泳，应用明胶酶谱法检测转染前、后骨肉瘤细胞上清中MMP-2和MMP-9活性的改变。
　　 6.酶联免疫吸附实验(ELISA):收集miR-34a或miR-200b mimics转染的骨肉瘤细胞上清，应用ELISA法检测转染前、后骨肉瘤细胞上清中VEGF活性的改变。
　　 7.细胞增殖实验:miR-34a或miR-200b mimics转染前、后骨肉瘤细胞种板，应用MTT法检测转染对骨肉瘤细胞增殖的影响。
　　 8.细胞侵袭实验:miR-34a或miR-200b mimics转染前、后骨肉瘤细胞种入已铺好Matrigel基质胶的Tranwell小室上室，行无血清培养48h，应用侵袭实验检测转染对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。
　　 9.HUVECs体外血管新生实验:miR-34a或miR-200b mimics转染前、后骨肉瘤细胞种板，行无血清培养24h，离心取上清，即为条件培养基;将HUVECs细胞种入已铺好Matrigel基质胶的24孔板，加入条件培养基培养8h，应用HUVECs细胞管状形成实验检测转染对骨肉瘤细胞体外血管新生能力的影响。
　　 研究结果:
　　 1.大蒜素影响骨肉瘤细胞中miRNAs的表达:
　　 1.1 miRNA Real-time RT-PCR结果显示，大蒜素(50μM)可上调U2OS细胞中miR-34a、miR-143、miR-145、miR-200b和miR-200c的表达，而下调miR-21的表达。
　　 1.2大蒜素(50μM)可上调SaOS-2细胞中miR-143、miR-145的表达，而下调miR-21的表达。
　　 1.3大蒜素(50μM)可上调MG-63细胞中miR-143、miR-145、miR-200b和miR-200c的表达，而下调miR-21的表达。
　　 2.下调Notch-1影响骨肉瘤细胞中miRNAs的表达:
　　 2.1 miRNA Real-time RT-PCR结果显示，Notch-1 siRNA转染后，U2OS细胞中miR-34a、miR-143、miR-145、miR-200b和miR-200c的表达较对照组明显升高。
　　 2.2 Notch-1 siRNA转染后，U2OS细胞中miR-21的表达较对照组明显降低。
　　 3.上调miR-34a和miR-200b影响骨肉瘤细胞中Notch-1信号通路和MMPs、VEGF的表达及活性:
　　 3.1 miRNA Real-time RT-PCR结果显示，miR-34a或miR-200b mimics转染后，U2OS细胞中miR-34a、miR-200b的表达较对照组明显增高，说明miRNAmimics能有效上调U2OS细胞中miRNA的表达。
　　 3.2 Western blot结果显示，miR-34a或miR-200b mimics转染后，U2OS细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表达较对照组明显降低。
　　 3.3明胶酶谱结果显示，miR-34a或miR-200b mimics转染后，U2OS细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性较对照组明显减低。
　　 3.4 ELISA结果显示，miR-34a或miR-200b mimics转染后，U2OS细胞上清中VEGF的分泌较对照组明显减少。
　　 4.上调miR-34a和miR-200b影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和血管新生:
　　 4.1 MTT结果显示，miR-34a或miR-200b mimics转染后，U2OS细胞增殖能力较对照组明显减弱。
　　 4.2侵袭实验结果显示，miR-34a或miR-200b mimics转染后，U2OS细胞侵袭能力较对照组明显减弱。
　　 4.3 HUVECs体外血管新生实验结果显示，miR-34a或miR-200b mimics转染后，U2OS细胞上清诱导HUVECs细胞管状形成较对照组明显减少。
　　 结论:
　　 1.大蒜素可靶向Notch-1-miRNA调节环路，抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和血管新生，从而发挥抗骨肉瘤作用。
　　 2.上调miR-34a或miR-200b可抑制Notch-1信号通路和MMPs、VEGF的表达及活性，减弱骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和体外血管新生能力，从而抑制骨肉瘤发生、发展。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

第三部分

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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