Sirt去乙酰化酶在调节血管内皮细胞自噬反应中的角色

摘要

随着世界人口的老龄化，心血管病以其高发病率成为影响人类健康的重要疾病之一。血管内皮细胞的正常功能对维持血管系统稳态、预防血管病变的发生具有重要的意义。内皮细胞功能受血液中层流剪切力（即血液流动对血管壁造成的水平方向切应力）的调节。生理状况下稳定的层流剪切力能够维持血管内皮正常功能和代谢，而非生理性的层流剪切力（过高、过低或震荡型的剪切力）可诱发血管内皮功能障碍，导致多种血管疾病（如动脉粥样硬化等）的发生。
　　 细胞自噬是细胞在溶酶体系统作用下对已摄取的或原有的细胞组分进行自我消化的过程，是细胞在应激状态下维持细胞内大分子蛋白、细胞器循环和质量的主要方式。自噬对内皮细胞功能具有重要的调节作用:增强细胞对细菌感染的抵抗能力;提高细胞对饥饿、缺氧、高温以及高激素水平的耐受;对抗细胞凋亡等作用。但是，血液层流剪切力对内皮细胞自噬反应的调节尚未见报道。
　　 自噬反应的激活受多条信号转导通路的调控（如胰岛素受体-雷帕霉素受体通路、脂多糖-AMPK通路、整联蛋白通路和钙离子通路等），研究表明细胞因子、糖基化产物和氧化低密度脂蛋白等多种因子参与内皮细胞自噬反应过程，但具体作用机制尚未阐明。自噬过程包括自噬小体（自噬相关蛋白Atg组成，双层膜为特征）和自噬溶酶体（自噬小体与溶酶体结合）形成。Sirtuin是NAD依赖的去乙酰化酶家族(Sirt1～Sirt7)，在维持基因沉默、基因组的稳定、细胞代谢和延长细胞寿命过程中发挥重要作用。进一步研究发现某些SIRT家族成员（如Sirt1）可能参与细胞自噬反应调节，而血液层流剪切力可以影响内皮细胞中SIRT表达和功能。然而，目前Sirt在剪切力诱导的内皮细胞自噬反应中的作用和机制尚不明确。
　　 本研究目的是明确血管内皮细胞中Sirt去乙酰化酶调节自噬功能的作用和机制，对于探讨血液层流剪切力参与血管疾病发生发展的生物学机制、指导临床靶向治疗具有重要的意义。
　　 本论文包括了以下三部分研究内容:
　　 第一部分:血液层流剪切力对内皮细胞自噬反应的影响
　　 第二部分:Sirt1在介导内皮细胞自噬反应中的作用及生物学机制
　　 第三部分:Sirt2在内皮细胞氧化应激中作用的系统生物学研究
　　 第一部分:血液层流剪切力对内皮细胞自噬反应的影响
　　 研究目的:
　　 探讨剪切力是否能够调节内皮细胞的自噬功能;探讨剪切力是否通过改变细胞内氧化还原水平参与内皮细胞自噬功能的维持。
　　 研究方法:
　　 1、体外实验:采用M199培养基作为流体，用剪切力(20dyne/cm2)作用原代人脐静脉内皮（HUVECs）和人毛细血管内皮细胞8小时后，将细胞分为Shear组（剪切力作用）和Static组（无剪切力作用），培养4小时。体内实验:24周龄的C57BL雄性小鼠给予右侧颈总动脉结扎48小时，左侧颈总动脉作为假手术对照。
　　 2、免疫荧光检测HUVECs内Actin-beta的排列方向。自噬功能的检测包括下列方法:吖啶橙染色观察细胞内pH值的变化;DCFH-DA直接荧光标记观察细胞内ROS的变化;免疫荧光方法计数LC3的点状聚集，以LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比评价自噬小体的形成:WB检测LC3的蛋白表达;RT-PCR检测自噬相关基因ATG5、Beclin-1(BECN1)、MAP_LC3的表达。用活性氧清除剂EUK-134预处理后，继续采用上述实验方法观察是否能逆转剪切力对自噬功能的调节。
　　 3、人毛细血管内皮细胞转染pEGFP-LC3质粒，共聚焦显微镜观察Shear对LC3点状聚集的影响，以LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比表示;用EUK-134预处理后，仍采用上述方法观察是否能逆转剪切力对自噬的调节。
　　 4、免疫组化观察C57BL小鼠双侧颈总动脉结扎部位至主动脉弓段LC3水平，透射电子显微镜观察双侧动脉内皮细胞内自噬小体的形成。
　　 研究结果:
　　 1、免疫荧光检测发现剪切力作用12小时能够使内皮细胞Actin-beta沿流体流动的方向排列，证明在体外成功建立了剪切力刺激细胞的模型。
　　 2、Shear可以维持内皮细胞自噬反应:与Static组相比，Shear组LC3蛋白表达显著升高，LC3免疫荧光的点状聚集明显增多，细胞溶酶体酸化增强。
　　 3、Shear对HUVECs自噬反应的调节是氧化-还原依赖的:与Static组相比，Shear组细胞内活性氧产生（DCFH-DA荧光）明显增多;活性氧清除剂EUK-134明显逆转内皮细胞自噬相关基因的高表达。
　　 4、与Static组相比，Shear组LC3的点状聚集明显减少(EUK-134处理)，表明过表达pEGFP-LC3的人毛细血管内皮细胞中剪切力对于的自噬反应的调节也是氧化-还原依赖的。
　　 5、C57BL小鼠右侧颈总动脉结扎48小时后血管内皮LC3表达减少，血管内皮细胞内自噬小体减少。
　　 结论:
　　 1、剪切力能够维持内皮细胞自噬反应。
　　 2、剪切力对内皮细胞自噬功能的维持是氧化-还原依赖的。
　　 第二部分:Sirt1在介导内皮细胞自噬反应中的作用及生物学机制
　　 研究目的
　　 观察H2O2是否可以模拟剪切力对内皮细胞自噬功能的调节，明确Sirt1在对内皮细胞自噬功能维持中的作用，探讨Sirt1调节内皮细胞自噬反应的生物学机制。
　　 研究方法:
　　 1、SIRT1及细胞内自噬及相关信号蛋白的检测:H2O2处理HUVECs后，RT-PCR检测SIRT表达，WB检测Sirt1、LC3、mTOR、p-mTOR、ULK、p-ULK表达;Sirt1抑制剂Ex-527预处理H2O2刺激的内皮细胞，RT-PCR检测自噬相关基因(LC3、ATG5、Beclin-1的表达。siRNA技术敲除Sirt1后，WB检测LC3表达，siRNA技术敲除人毛细血管内皮细胞Sirt1后，免疫荧光计数LC3的点状聚集，并计算其占总细胞的百分比;剪切力模型中，用Ex-527处理转染pEGFP-LC3质粒的人毛细血管内皮细胞，共聚焦显微镜观察LC3的点状聚集阳性细胞，并计算其占总细胞的百分比。在转染Flag-SIRT1质粒或白藜芦醇作用后的内皮细胞中，WB检测LC3表达。
　　 2、Sirt1-Foxo1a信号通路的检测:过表达Foxo1a的内皮细胞给予H2O2、白藜芦醇刺激后，免疫共沉淀法检测Foxo1a的乙酰化水平。内皮细胞分别转染固有活性的Foxo1a的质粒和野生型Foxo1a的质粒后，白藜芦醇继续作用后，RT-PCR法检测自噬相关基因(LC3、ATG5、Belcin-1)表达变化。RT-PCR法检测Foxo1asiRNA与Flag-SIRT1共转染对自噬相关基因(LC3、ATG5、Belcin-1)表达的影响。
　　 3、免疫荧光法观察转染Flag-SIRT1质粒后，Foxo1a在HUVECs中的核转位，RT-PCR检测Foxo1a靶基因和自噬相关基因(LC3、ATG5、Belcin-1)表达变化。
　　 研究结果:
　　 1、RT-PCR检测到内皮细胞SIRT1-7表达。
　　 2、剪切力增强内皮细胞SIRT1的表达。
　　 3、H2O2对抑制自噬反应的mTOR通路无显著影响:H2O2处理HUVECs后，mTOR、p-mTOR、ULK、p-ULK表达无显著变化。
　　 4、H2O2上调内皮细胞SIRT1的表达:H2O2以时间依赖方式促进内皮细胞SIRT1基因和蛋白表达。
　　 5、Sirt1激活剂白藜芦醇能够增强内皮细胞自噬反应:白藜芦醇以时间依赖方式促进内皮细胞Sirt1、LC3表达。
　　 6、白藜芦醇上调过表达Foxo1a的内皮细胞中自噬相关基因的转录表达。
　　 7、H2O2、白藜芦醇降低了过表达Foxo1a的内皮细胞中Foxo1a的乙酰化表达。
　　 8、Flag-SIRT1上调了自噬相关基因的转录表达。
　　 9、Sirt1抑制剂能够抑制内皮细胞自噬反应:Sirt1抑制剂Ex-527预处理HUVECs后,H2O2对HUVECs自噬相关基因在mRNA水平上的升高作用被抑制。用Ex-527处理转染pEGFP-LC3质粒的人毛细血管内皮细胞，Shear组LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比较Static组升高的作用被抑制。
　　 10、Sirt1的siRNA能够抑制内皮细胞自噬反应:Sirt1的siRNA转染HUVECs和人毛细血管内皮细胞后，H2O2继续作用后LC3表达降低，LC3的点状聚集减少。
　　 11、Sirt1和自噬反应对氧化应激状态下内皮细胞活性的影响:Ex-527、自噬反应抑制剂3-MA预处理降低了内皮细胞的活力及对H2O2的耐受。
　　 12、Sirt1对Foxo1a在细胞内定位的作用:分别转染Flag-SIRT1质粒和应用白藜芦醇后，Foxo1a在HUVECs中发生核转位;同时，Flag-SIRT1也提高了自噬相关基因的转录水平。
　　 13、Foxo1a过表达对内皮细胞自噬反应的影响:内皮细胞转染带活性Foxo1a的质粒和野生型Foxo1a的质粒后，自噬相关基因MAP_LC3转录水平明显升高。
　　 14、Foxo1a对过表达Flag-SIRT1的内皮细胞自噬反应的影响:共转染Foxo1a的siRNA与Flag-SIRT1质粒后，HUVECs自噬相关基因表达无显著变化。
　　 结论:
　　 Sirt1介导剪切力诱发的自噬反应，Sirt1通过去乙酰化Foxo1a调节自噬相关基因表达是Sirt1调节内皮细胞自噬反应的机制之一。
　　 第三部分SIRT2在内皮细胞氧化应激中作用的系统生物学研究
　　 研究目的:
　　 探讨内皮细胞Sirt2在氧化应激中的作用。
　　 研究方法:
　　 采用基因芯片和RT-PCR实验验证原代人脐静脉内皮细胞Sirt2沉默后，氧化应激作用下基因表达的变化。MTS法检测内皮细胞活性。
　　 研究结果:
　　 1、H2O2诱导内皮细胞的氧化应激反应
　　 2、氧化应激作用下SIRT2表达升高。
　　 3、Sirt2沉默对内皮细胞氧化应激状态下基因转录组的影响:Sirt2沉默后有340个基因的表达发生变化，这些基因主要参与肌动蛋白结合和细胞代谢的生理过程。
　　 4、Sirt2敏感基因功能的生物信息学分析:转染Sirt2的siRNA调节的基因参与跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号、铁离子运输、蛋白质的运输和定位等。这些基因和相关的功能在很大程度上与转染Sirt1的siRNA后的相关功能是不重叠的。
　　 5、氧化应激状态下AGK2（抑制Sirt2）对内皮细胞活性起保护作用。
　　 结论:
　　 Sirt2去乙酰化在内皮细胞氧化应激中起到重要作用，与Sirt1作用不同，内皮细胞Sirt2的抑制可能起到对细胞活性和生存的保护作用。

目录

声明

摘要

英文简写

全文背景介绍

第一部分：血流剪切力对内皮细胞自噬反应的影响

前言

材料和方法

1．实验材料

2 实验分组与处理

3 实验方法与检测指标

4 统计学分析

结果

讨论

结论

参考文献

附图一

第二部分：Sirt1在介导内皮细胞自噬反应中的作用及生物学机制

前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验分组及处理

3 研究方法及检测指标

4 统计学分析

结果

讨论

结论

参考文献

附图二

第三部分 SIRT2在内皮细胞氧化应激中作用的系统生物学研究

前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验分组与处理

3 实验方法与检测指标

4 统计学分析

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

附图三

附表一

致谢

博士期间发表论文

学位论文评阅及答辩情况表

附外文论文

Global Gene Expression Profiling Reveals Functional Importance of Sirt2 in Endothelial Cells under Oxidative Stress

Redox Involves in Shear Stress Regulating Autophagy in Endothelial Cell