中国人群移植抗原特异慢粒白血病表位疫苗制备及免疫活性研究

摘要

研究背景
　　慢性粒细胞性白血病(CML)是一种造血干细胞慢性克隆增殖性疾病。BCR/ABL融合基因或费城染色体为其特征性的形态学异常。BCR/ABL融合基因同时也表达于一部分急性淋巴细胞白血病(ALL)的病人中。酪氨酸激酶阻滞剂的出现使得慢性粒细胞性白血病的治疗取得了巨大的进展，但是由于微小残留病变的存在以及耐药的出现，慢性粒细胞性白血病仍难以治愈。因此，如何清除微小残留病变成为治疗白血病过程中的重要问题。有研究报道，包括疫苗在内的免疫疗法对CML的治疗有一定的疗效。来源于P210融合蛋白的多肽在体外可诱导出MHC限制性的T淋巴细胞的增殖。另外，WT1基因也表达于慢性粒细胞性白血病及急性淋巴细胞白血病中，因此，WT1多肽也可诱导出特异性的免疫反应，用来治疗CML的微小残留病变。目前，BCR/ABL及WT1多肽疫苗已取得了巨大的进展，但是，这些疫苗大多只针对以单一HLA表位并大多适用于欧美人群。因此，针对于中国人群HLA表型的多肽疫苗有待于进一步研究。
　　目的
　　通过筛选针对CML多种抗原蛋白的免疫表位，合成一条对应各抗原表位的串联核苷酸序列，包装入慢病毒过表达系统，感染DC细胞，制备成HLA特异性慢性粒细胞性白血病表位疫苗，并在体外对其进行免疫活性研究。为慢性粒细胞性白血病的免疫治疗提供了新的方向。
　　方法
　　1、多肽表位的选择:通过查阅CML表位相关文献，从中选取针对CML抗原蛋白的免疫表位，通过SYFPEITHIMHC表型及表位预测系统和MAPPP蛋白酶体降解预测系统对所选表位进行表位肽预测和MAPPP蛋白酶体切割-表位生成预测后，通过重叠区扩增基因法及PCR技术合成CML串联表位全长基因。
　　2、HLA特异慢粒白血病DC疫苗的制备及鉴定:利用基因工程的相关方法把目的基因包装入慢病毒过表达系统。收集正常人外周血单个核细胞(PBMC)，体外诱导DC细胞。重组慢病毒感染DC细胞后制备成HLA特异慢粒白血病疫苗。实时荧光定量方法(qRT-PCR)检测目的基因在慢病毒感染后的DC细胞中的mRNA水平的表达情况。且在荧光显微镜下观察DC细胞内荧光的表达。
　　3、HLA特异慢粒白血病疫苗的体外免疫活性鉴定:免疫磁珠方法分选PBMC中的CD3+T淋巴细胞，流式细胞学方法检测所分选的T淋巴细胞的纯度。DC疫苗与CD3+T淋巴细胞共培养后激活其成为CTL细胞，CTL细胞与靶细胞共培养，乳酸脱氢酶(LDH)释放试验测定T细胞的杀伤效率;ELISPOT方法检测CTL细胞IFN-γ的分泌。
　　结果
　　1、通过SYFPEITHI和MAPPP预测及查阅相关文献，选取50个免疫表位，这些免疫表位包含多种不同HLA表型的BCR/ABL及WT1抗原。
　　2、成功合成CML串联表位全长基因，并且成功包装入慢病毒过表达系统。在体外成功诱导出DC细胞，并将慢病毒感染DC细胞，制备成HLA特异慢粒细胞DC疫苗。PCR证实目的基因在DC细胞中成功表达。荧光显微镜下可观察到病毒感染后的DC细胞中有荧光表达。
　　3、LDH释放试验证实实验组T细胞杀伤效率比阴性对照组及空白对照组有升高的趋势。ELISPOT方法检测到实验组T细胞可分泌更高水平的IFN-γ。
　　结论:
　　1、我们成功构建了移植抗原(HLA)特异慢性粒细胞白血病表位疫苗。
　　2、我们在体外验证了其免疫活性，证实其对慢粒白血病细胞存在杀伤作用，且能分泌更高水平的IFN-γ，为CML的治疗及清除MRD提供了一种新的策略和方法。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

1、实验材料

2、实验方法

结果

1．成功选取HLA特异的CML串联表位并进行中国人群覆盖率的预测

2．核苷酸序列的合成及包装入慢病毒过表达系统

3．体外成功诱导DC细胞

4．重组慢病毒成功感染HEK293细胞及DC细胞

5．流式细胞学鉴定分选的CD3+T淋巴细胞的纯度

6．收集病例的临床特征及HLA表型检测

7．CML特异性CTL细胞对靶细胞的杀伤作用

8．DC-BCR／ABL*WT1刺激CML特异性CTL细胞大量分泌IFN-γ

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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