SIRT3基因干扰后对ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞ICAM-1、E-selectin表达的影响

摘要

研究背景与目的：
　　炎症在冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病过程中起重要作用。动脉粥样硬化的各个过程均有炎症介质如各种粘附分子等参与炎症反应。减轻内皮细胞损伤的炎症反应是缓解动脉粥样硬化的重要途径。目前，研究显示人类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶3(SIRT3)在能量代谢、信号转导、心肌细胞肥大、长寿等机制方面发挥重要作用，但其在动脉粥样硬化内皮细胞损伤反应过程中的作用国内外少见报道。因此，本研究旨在探讨人SIRT3与内皮细胞损伤过程中炎性因子的调控关系，进一步揭示SIRT3在动脉粥样硬化发展过程中的作用。
　　研究方法：
　　1.干扰序列的筛选
　　(1)人主动脉内皮细胞培养:人主动脉内皮细胞，用内皮细胞培养基+1％内皮生长因子+5％胎牛血清的培养液在37℃、5％CO2条件下贴壁培养，选择3-7代生长状态良好的细胞用于实验。
　　(2)分组与转染:将生长状态良好的细胞随机分为空白对照组、阴性对照组、转染试剂对照组、SIRT3 siRNA(1、2、3、4)组。待细胞70％-80％融合时用转染试剂hiperfect进行转染。转染试剂对照组只加转染试剂不加干扰序列。阴性对照组添加阴性对照序列和转染试剂。转染24h后检测相关指标。
　　(3)显微镜观察细胞形态变化。
　　(4)荧光倒置显微镜观察阴性对照组荧光蛋白表达。
　　(5)qRT-PCR检测各组SIRT3 mRNA表达。
　　(6)Western blot检测各组SIRT3蛋白质的表达。
　　2、SIRT3干扰后检测ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞SIRT3 mRNA，ICAM-1、E-selectin蛋白的表达。
　　(1)实验随机分为空白对照组、siRNA组、(20、30、40μg/mL)ox-LDL组、siRNA+(20、30、40μg/mL)ox-LDL组。ox-LDL各组分别按浓度加入ox-LDL刺激6h;siRNA为筛选出的最佳SIRT3干扰序列，siRNA+ox-LDL组为转染24h后加入ox-LDL刺激6h。
　　(2)qRT-PCR检测各组SIRT3 mRNA的表达。
　　(3)流式细胞仪检测ICAM-1、E-selectin抗体的平均荧光强度值。
　　结果：
　　1.干扰序列筛选结果
　　(1)光学显微镜下，与空白对照组相比，SIRT3 siRNA各组的细胞多数体积增大，细胞均质性降低，细胞间隙增大。这些特征在SIRT3 siRNA2组较明显。
　　(2)与光学显微镜下同一视野对比，阴性对照90％以上细胞显示绿色荧光。
　　(3)与各对照组相比，4条SIRT3 siRNA序列均在不同程度上下调了SIRT3mRNA的表达（P均＜0.05）。其中:SIRT3 siRNA2组干扰效果最好，沉默效率为88.616％。
　　(4)4个SIRT3 siRNA组分别与各对照组相对灰度值相比，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。其中:SIRT3 siRNA2组干扰效果最为显著，沉默效率为:80.372％。
　　2.SIRT3干扰后不同浓度ox-LDL刺激，SIRT3 mRNA，ICAM-1、E-selectin蛋白表达
　　(1)与空白对照组相比，ox-LDL各浓度组的SIRT3 mRNA相对表达量差异均有统计学意义（P均＜0.05）;且随ox-LDL浓度增加，mRNA表达逐渐降低(P均＜0.05)。与空白对照组相比，siRNA组的SIRT3 mRNA相对表达量明显降低(P＜0.001)。siRNA+ox-LDL各组的SIRT3 mRNA相对表达量与siRNA组相比，无统计学差异（P均＞0.05）。
　　(2)与空白对照组相比，siRNA组及ox-LDL各浓度组的ICAM-1MFI均无统计学差异（P均＞0.05）。与siRNA组相比，siRNA+ox-LDL各组的ICAM-1MFI差异有统计学意义（P均＜0.05）;随着ox-LDL浓度增加，siRNA+ox-LDL各组的ICAM-1MFI依次明显增加（P均＜0.05）。
　　(3)与空白对照组相比，siRNA组及20、30μg/mL ox-LDL组的E-selectin MFI无统计学差异（P均＞0.05），40μg/mL ox-LDL组的E-selectin MFI显著增加(P＜0.05)。与siRNA组相比，siRNA+ox-LDL各组的E-selectin MFI差异有统计学意义（P均＜0.05）;且随着ox-LDL浓度的增加，siRNA+ox-LDL各组的E-selectin MFI依次明显增加（P均＜0.05）。
　　结论：
　　1、本实验为后续研究成功筛选了SIRT3基因小干扰RNA序列。准确沉默SIRT3基因，为研究人SIRT3与其他基因的调控关系提供便利。
　　2、通过本实验研究发现，较低浓度ox-LDL刺激时，人主动脉内皮细胞SIRT3基因表达显著增高;随ox-LDL浓度进一步增加，SIRT3表达反而降低。提示SIRT3作为保护因子存在代偿作用，但其代偿作用受到ox-LDL浓度的限制。
　　3、SIRT3基因与ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞ICAM-1、E-selectin表达相关。
　　4、SIRT3可能是促进内皮细胞损伤修复和抑制动脉粥样硬化进展必需的分子，但其具体机制有待深入研究。