人内源性抗菌肽Cathelicidin/LL-37在COPD气道粘液高分泌中的作用及机制研究

摘要

研究背景：
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是世界范围内严重危害人类健康的常见和多发疾病，当前其发病机制未明，防治形势非常严峻。气道粘液高分泌是除慢性气道炎症和肺气肿外COPD的又一特征性病理改变，是COPD发病率和死亡率升高的独立危险因素，因此气道粘液高分泌的发生机制研究，已成为COPD防治领域的关注热点。多种与COPD发病密切相关的因素，如香烟烟雾、病原微生物及其产物（如脂多糖、绿脓菌素），炎症细胞（如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞）及炎症因子（如IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-4）等，可直接或间接作用于气道上皮细胞，在气道粘液高分泌的形成和维持中发挥重要作用。相关的机制研究表明，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在上皮细胞的粘液分泌过程中发挥重要介导作用，而在其下游诸多信号分子中，MAPK家族成员ERK占据了非常重要的地位，可形成EGFR-ERK通路。另外，金属蛋白酶家族的某些成员也参与到粘蛋白MUC5AC（气道粘液的一种主要大分子成分）的诱导过程中，如细胞膜上的肿瘤坏死因子α转换酶(TNF-αconvertingenzyme，TACE)可剪切锚定在胞膜表面的pro-TGF-α，pro-amphiregulin，pro-HB-EGF等前体分子，释放出可溶性的活性成分TGF-α，amphiregulin(AR)和HB-EGF，这些活性成分作为EGFR的配体与之结合，通过配体-受体反应转激活EGFR及下游信号通路，促进粘蛋白的合成和分泌。在香烟提取物(cigarette smoke extract，CSE)、中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase，HNE)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、脂多糖和绿脓菌素、曲霉菌等诱导气道上皮细胞粘蛋白生成的过程中，TACE介导的EGFR转激活作用已得到证实。
　　近年来，天然免疫系统在COPD发病中的作用受到重视。Cathelicidin是人类内源性抗菌肽（anti microbial peptides，AMPs）的重要成员，是天然免疫系统的重要组成部分，广泛表达于机体多种组织。Cathelicidin具有多种生物学功能，除具有针对细菌、真菌、病毒等的抗微生物活性外，还在炎症/免疫反应、损伤修复、细胞增殖和凋亡等病理生理过程中发挥重要的调控作用。人们注意到，Cathelicidin的调控活性与COPD发病的多个病理环节有较好的契合，推测Cathelicidin可能在COPD的发病中占有一定地位。相关研究表明，COPD患者诱导痰、肺组织、支气管肺泡灌洗液以及呼吸道上皮衬液中LL-37(Cathelicidin发挥作用的活性片段)的表达均显著升高，提示LL-37与COPD的发病密切相关;我们的前期研究则发现，LL-37能诱导气道上皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡并伴随IL-8、TNF-α等炎症因子的释放，提示LL-37可能在COPD发病的气道炎症和肺气肿形成两个病理过程中发挥作用。然而，对于COPD的气道粘液高分泌过程，LL-37是否在其中发挥作用尚不得而知。有文献报道，LL-37可通过转激活EGFR-ERK信号通路，活化气道上皮细胞，促进炎症因子IL-8的释放;LL-37还可通过MAPK途径上调人结肠上皮细胞粘蛋白基因的表达，增加粘蛋白合成。根据LL-37在COPD患者气道内的高表达状态以及LL-37激活相关信号通路的能力，我们提出假设，推测气道局部高水平的LL-37能够促进气道粘蛋白的生成，从而参与气道粘液高分泌状态的形成，并因此在COPD的发病及病情进展中发挥重要作用。
　　为验证这一假设，本研究在人体标本和体外细胞两个层面探讨了LL-37对COPD气道粘液分泌的影响及其可能的分子机制。
　　目的：
　　观察COPD患者小气道局部内源性抗菌肽Cathelicidin/LL-37和粘蛋白的表达情况，探讨Cathelicidin/LL-37对人气道上皮细胞粘蛋白MUC5AC的体外诱导效应及相关分子机制，初步阐明Cathelicidin/LL-37在COPD气道粘液高分泌中的作用。
　　方法：
　　1.研究对象和一般资料收集
　　选取因肺外周肿瘤需行肺叶切除术的稳定期COPD患者15例(COPDgroup)、肺功能正常的吸烟者15例(NormalSmokergroup，NSgroup)和肺功能正常的不吸烟者15例(NormalNon-smokinggroup，NNgroup)，术前收集性别、年龄、吸烟史等一般资料，并行常规肺通气功能检查，记录一秒量(forcedexpiratoryvolumein1sec，FEV1)和一秒率(FEV1/forcedvolumecapacity,FEV1/FVC)。COPD诊断的确立根据GOLD(2010)标准。
　　2.人体组织病理研究
　　术中收集手术切除的外周肺组织，距肿瘤边缘5cm以上，以排除肿瘤的影响。对肺组织切片进行HE染色、糖原过碘酸雪夫(PeriodicAcid-Schiffstain，PAS)染色和免疫组织化学染色，比较3组标本的形态学特征以及外周小气道上皮LL-37和粘蛋白MUC5AC的表达情况，分析LL-37、粘蛋白MUC5AC与肺通气功能指标，以及LL-37与粘蛋白MUC5AC之间的相关性。
　　3.体外研究
　　3.1体外培养人支气管上皮NCI-H292细胞，香烟提取物(cigarettesmokeextract，CSE)和LL-37合成肽分别以不同刺激浓度、不同刺激时间作用于细胞，MTT法检测CSE和LL-37合成肽对细胞活力的影响，选取细胞活力不低于80％的刺激模式为后续实验提供参考范围。
　　3.2LL-37合成肽以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞，收集培养液上清和细胞裂解物，用ELISA分别检测其中粘蛋白MUC5AC含量，同时BCA法检测细胞裂解物中总蛋白含量。粘蛋白MUC5AC总量计算公式为:（上清中MUC5AC含量十细胞裂解物中MUC5AC含量）/细胞总蛋白含量。为比对LL-37作用的特异性，乱码LL-37（scrambleLL-37，sLL-37）合成肽以相同的作用模式刺激细胞，检测粘蛋白MUC5AC生成的总量。
　　3.3在培养体系中有CSE（0.005cig/ml）存在的情况下，LL-37合成肽和sLL-37合成肽分别以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞，ELISA检测细胞粘蛋白MUC5AC生成的总量。
　　3.4在培养体系中有和无CSE(0.005cig/ml)存在的情况下，LL-37合成肽以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞，ELISA检测培养上清中IL-8的水平;以重组人IL-8单独刺激NCI-H292细胞，或经IL-8中和抗体预处理细胞后再给予LL-37合成肽刺激，ELISA检测粘蛋白MUC5AC生成的总量。
　　3.4CSE以不同作用浓度刺激NCI-H292细胞，免疫荧光染色后激光共聚焦扫描检测LL-37在细胞中的表达范围和强度，同时ELISA检测上清液中LL-37的含量。
　　3.5LL-37合成肽以连续浓度梯度和时间梯度刺激NCI-H292细胞，收集上清和细胞裂解物，ELISA检测上清中TGF-α的含量，Westernblotting检测细胞裂解物中ERK、EGFR的磷酸化水平，荧光共振能量转移法（fluorescence resonance energy transfer，FRET）检测细胞的TACE活性。
　　3.6用TACE抑制剂TAPI-1，EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478，ERK上游MEK分子的抑制剂U0126，以及TGF-α中和抗体、EGFR中和抗体、AR中和抗体和HB-EGF中和抗体等预处理NCI-H292细胞后，再给予LL-37合成肽刺激，检测步骤3.5中相应的指标。
　　3.7LL-37合成肽刺激NCI-H292细胞后，利用荧光探针DCF-DA检测胞内活性氧(ROS)水平;用抗氧化剂DMTU和nPG预处理NCI-H292细胞后再给予LL-37合成肽刺激，FRET检测细胞TACE活性，ELISA检测粘蛋白MUC5AC总的生成量。
　　3.8用蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)抑制剂Staurosporine预处理NCI-H292细胞后再给予LL-37合成肽刺激，FRET检测细胞TACE活性，ELISA检测粘蛋白MUC5AC生成的总量。
　　结果：
　　1.一般资料比较
　　3组研究对象在年龄和性别比例上无显著性差异（均P＞0.05），COPD组的FEV1％较肺功能正常吸烟组和肺功能正常不吸烟组明显降低（均P＜0.05），肺功能正常吸烟组和COPD组的吸烟史（吸烟指数）无显著性差异(P＞0.05)。
　　2.人体组织病理学研究
　　HE染色结果显示，COPD组小气道局部炎症征象比较明显，上皮完整性破坏;肺功能正常不吸烟组小气道无明显炎症征象，上皮保持完整;肺功能正常吸烟组小气道的形态特征介于前两组之间。
　　糖原PAS染色结果显示，COPD组小气道上皮染色非常明显，杯状细胞数明显增多;肺功能正常不吸烟组小气道上皮未见明显染色，杯状细胞数很少;肺功能正常吸烟组小气道上皮也有较明显染色，杯状细胞数增多，但少于COPD组。PAS染色面积百分比在COPD组最高，肺功能正常不吸烟组最低，肺功能正常吸烟组介于前两组之间(均P＜0.05)。
　　免疫组化染色结果显示，LL-37和MUC5AC的着色部位主要位于COPD患者外周小气道上皮内，其中LL-37分布广泛，位于纤毛细胞、杯状细胞等多种细胞内，而粘蛋白MUC5AC分布较单一，主要位于杯状细胞内。LL-37和粘蛋白MUC5AC染色强度的变化趋势相似，都是在COPD组最高，肺功能正常不吸烟组最低，肺功能正常吸烟组介于两组之间(均P＜0.05)。
　　相关性分析表明，小气道上皮中LL-37和粘蛋白MUC5AC的表达均与肺功能指标FEV1％呈显著负相关（分别有r=-0.606，P＜0.01;r=-0.641，P＜0.01），而LL-37与粘蛋白MUC5AC呈显著正相关（r=0.776，P＜0.01）。
　　3.体外研究
　　3.1.细胞活力的MTT检测结果显示，LL-37合成肽在0-10μg/ml的浓度范围内刺激细胞24h，NCI-H292细胞活力不低于80％;CSE在0-0.015cig/ml的浓度范围内刺激细胞24h，NCI-H292细胞活力不低于80％。
　　3.2.LL-37合成肽单独刺激NCI-H292细胞可诱导粘蛋白MUC5AC的生成，并呈明显的浓度-效应和时间-效应关系（均P＜0.05）;在CSE(0.005cig/ml)存在的情况下，LL-37合成肽能以同样的作用模式诱导粘蛋白MUC5AC的生成，且诱导效应较LL-37合成肽单独刺激时更强（均P＜0.05）。sLL-37合成肽对NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC的生成无明显影响(P＞0.05)。
　　3.3.LL-37合成肽单独刺激NCI-H292细胞可诱导NCI-H292细胞释放IL-8，并呈明显的浓度-效应和时间-效应关系（均P＜0.05）;在CSE(0.005cig/ml)存在的情况下，LL-37合成肽能以同样的作用模式诱导IL-8的释放，且诱导效应较LL-37合成肽单独刺激时更强（均P＜0.05）;重组人IL-8可刺激NCI-H292细胞生成粘蛋白MUC5AC，而IL-8中和抗体预处理细胞可显著抑制LL-37合成肽诱导的粘蛋白MUC5AC生成（均P＜0.05）。
　　3.4.CSE刺激可诱导气道上皮NCI-H292细胞LL-37表达上调。激光共聚焦扫描图像显示，经CSE刺激后细胞中LL-37呈强阳性表达;ELISA结果显示，经CSE刺激后培养液上清中LL-37含量也明显增加，且这种增加依赖于CSE的刺激浓度（均P＜0.05）。
　　3.5.LL-37合成肽可诱导ERK和EGFR磷酸化。当刺激时间为15min时，ERK的磷酸化达到峰值水平，在这一时间点，LL-37对ERK和EGFR磷酸化的诱导呈明显的剂量-效应关系。EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478可抑制LL-37合成肽诱导的EGFR、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成（均P＜0.05）;EGFR中和抗体(Ab-3)和ERK抑制剂U0126可抑制LL-37合成肽诱导的ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成（均P＜0.05）;AR中和抗体和HB-EGF中和抗体对LL-37合成肽诱导的EGFR磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成无明显影响（均P＞0.05）。
　　3.6.LL-37合成肽可浓度和时间依赖性地诱导NCI-H292细胞TACE活化，酶活性的非线性拟合结果表明，细胞TACE活性在刺激6h时达到峰值(P＜0.05)，其后直至24h，大致保持稳定（均P＞0.05）。在刺激粘蛋白MUC5AC生成的同时，LL-37合成肽还能同步诱导气道上皮细胞产生TGF-α，且也呈明显的浓度-效应和时间-效应关系（均P＜0.05）。TACE选择性抑制剂TAPI-1可抑制LL-37合成肽诱导的TGF-α释放、EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的产生（均P＜0.05）;TGF-α中和抗体和EGFR中和抗体可抑制LL-37合成肽诱导的EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的产生（均P＜0.05）;EGFR中和抗体可增加LL-37诱导的TGF-α水平(P＜0.05)。
　　3.7.LL-37合成肽对NCI-H292细胞内ROS水平无明显影响(P＞0.05);抗氧化剂DMTU和nPG对LL-37合成肽诱导的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成无明显影响（均P＞0.05）;PKC抑制剂Stauropsorine对LL-37合成肽诱导的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成也无明显影响（均P＞0.05）。
　　结论：
　　1.COPD患者外周小气道上皮中Cathelicidin/LL-37和粘蛋白MUC5AC均呈高表达状态，且二者密切相关;
　　2.Cathelicidin/LL-37可诱导人气道上皮细胞粘蛋白MUC5AC的产生，在香烟烟雾作用下，这种诱导效应更强;
　　3.Cathelicidin/LL-37诱导粘蛋白MUC5AC生成的机制可能涉及TACE-TGF-α-EGFR-ERK信号通路的激活，IL-8也在其中发挥了重要作用。
　　4.COPD患者外周小气道内高表达的Cathelicidin/LL-37可直接和间接促进气道粘液高分泌状态的形成，进而在COPD发病及病情进展中发挥作用。