PP2Cα磷酸酶中M2金属离子催化机制研究

摘要

由蛋白激酶引起的蛋白质磷酸化水平和由蛋白磷酸酶引起的蛋白质去磷酸化水平广泛存在于生物界各种基本的生命活动中，它们共同调节着细胞水平上的蛋白质磷酸化水平。其中，根据氨基酸序列比较、对抑制物的敏感性和对金属离子是否有依赖性，丝/苏氨酸残基蛋白磷酸酶(serine/threonine phosphatases)被分为PPP家族(phosphoprotein phosphatases)和PPM家族（金属离子依赖性蛋白磷酸酶，metal-dependent protein phosphatases）。PPM家族蛋白磷酸酶，也称为PP2C家族蛋白磷酸酶，它的磷酸酶催化活性依赖于各种金属离子，例如Mg2+或Mn2+等能够激活磷酸酶，而Cd2+、Zn2+或Ca2+等能够抑制磷酸酶活性。在PP2C家族成员中，所有成员都含有一个保守的双核金属离子（M1和M2）活性中心，但是，每一个金属离子在磷酸酶催化过程中如何发挥催化作用，这仍然不是很清楚。PP2Cα（Protein Phosphatase2Cα，也称为PPM1A）是PP2C家族的经典成员之一，它是PP2C家族中第一个被解析出晶体结构的，而且细胞功能和酶学分析研究的比较多，因此选择了PP2Cα作为研究对象。
　　在该项研究中，把PP2Cα的第38位天冬氨酸(Aspartic acid，Asp，D)突变成丙氨酸(Alanine，Ala，A)或者赖氨酸(lysine，Lys，K)作为特异性的研究工具。首先，构建了带有flag标签的PP2Cα野生型以及突变质粒，过表达HEK293和U251细胞，用western blot进行验证PP2Cα的细胞功能。其次，分别纯化了无标签和带his标签的PP2Cα野生型以及突变蛋白，进行了晶体结构的解析和酶活性分析，其中酶活性分析包括对一系列底物（pNPP，磷酸短肽和磷酸化ERK蛋白）的磷酸酶活性、Ki、PH profile和Leaving group dependence。
　　实验结果证明，把PP2Cα的D38突变之后降低了PP2Cα在细胞内对MAPK信号通路的调节能力，同时对一系列底物的磷酸酶活性都有不同程度的降低。另外，通过晶体结构的解析，发现了D38突变能够使酶活性中心的水分子结构网络重新分布，并且选择性的破坏了与M2金属离子之间的结合。最后，通过测定Ki、PH profile和Leaving group dependence，发现M2金属离子有助于酶与底物二价阴离子的结合过程，能够影响底物水解过程中的限速步骤，并且增加了磷-氧键断裂之后解离基团的稳定性。新发现的M2金属离子的催化作用，为研究PP2C家族中双核金属离子的功能提供了新的视野，而且，这也可以帮助更好的理解和研究PP2C家族磷酸酶成员的功能特异性和底物特异性。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

结果

1．1 PP2C家族中M2金属离子结合位点

1．2 第38位天冬氨酸(D)突变之后破坏了细胞内PP2Cα介导的信号通路

1．3 PP2Cα的第38位天冬氨酸突变后降低了对小分子pNPP、磷酸短肽和磷酸化蛋白质底物的酶活性

1．4 晶体结构揭示了第38位天冬氨酸突变破坏了金属离子与M2结合位点的结合

1．5 M2金属离子结合位点上金属离子的消失降低了与二价阴离子的结合能力

1．6 PP2Cα-WT、D38A和D38K蛋白质的pH dependence和leaving group dependence酶活性测定

讨论

结论

参考文献

致谢

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