脑源性神经营养因子对小鼠结肠平滑肌细胞的重构作用

摘要

背景：脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养因子家族的重要成员之一。在中枢及周围神经系统，BDNF通过与其高亲和力受体酪氨酸激酶受体B(tropomyosin-related kinase B，TrkB)结合，发挥调节神经元的发育、再生、修复、突触重构等生理作用。近年来，BDNF对胃肠动力的调节作用引起越来越多的关注。多项实验表明BDNF可以增加健康成年人的排便频率及增强大鼠粘膜刺激引起的离体结肠蠕动反射。结肠平滑肌细胞(smoothmuscle cell,SMC)作为结肠收缩的重要效应器官，BDNF对其是否有重构作用尚未见报道。
　　目的：
　　本研究通过引入BDNF基因敲除（BDNF+/-）小鼠，观察BDNF+/-小鼠结肠SMC超微结构的改变及结肠组织平滑肌α-肌动蛋白(smooth muscleα-actin，α-SMA)表达水平的变化，并应用BDNF和TrkB受体阻滞剂(K252a)体外干预C57bl/6小鼠结肠SMC，检测SMC形态及α-SMA、相关信号通路蛋白、细胞内钙离子浓度的变化，研究BDNF是否可以直接引起小鼠结肠平滑肌细胞的重构，进而影响肠道动力。
　　方法：
　　1.实验选用健康野生型C57B1/6(BDNF+/+)小鼠和BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠:电镜检测BDNF+/+小鼠和BDNF+/-小鼠结肠平滑肌细胞超微结构的差异;利用Western blotting方法检测BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠α-SMA表达水平的差异。
　　2.培养原代小鼠结肠平滑肌细胞:细胞免疫荧光鉴定原代结肠SMC是否有TrkB受体的表达;BDNF及K252a分别干预结肠平滑肌细胞，根据干预不同，分为三组①对照组②BDNF组③BDNF+ K252a组，三组细胞均于干预24小时后进行后续实验;细胞免疫荧光检测BDNF及K252a干预后结肠平滑肌细胞形态的改变;Western blotting检测干预后SMC中α-SMA，TrkB-PLC-Ca2+信号通路蛋白表达量的变化;钙离子成像检测BDNF和K252a干预下SMC中细胞内钙离子浓度的瞬时改变。
　　3.统计学处理:采用SPSS17.0软件，计量资料以(x)+s表示。BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠结肠组织α-SMA表达水平、干预前后细胞内钙离子相对荧光强度值的比较采用独立样本t检验;BDNF和K252a干预SMC，对照组、BDNF组及BDNF+K252a组细胞核大小、细胞密度、α-SMA表达水平、TrkB信号通路蛋白表达水平总体采用单因素方差分析，若总体差异有统计学意义，以Bonferroni法进行组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.与BDNF+/+小鼠相比，BDNF+/-小鼠结肠平滑肌细胞细胞间隙增宽，充填了大量的胶原纤维;平滑肌细胞的边界呈多个球状突起;胞体内肌丝的密度减少;
　　2.与BDNF+/+小鼠相比，BDNF+/-小鼠结肠α-SMA表达水平明显降低;
　　3.小鼠原代结肠SMC表达TrkB受体;
　　4.在BDNF作用下，免疫荧光结果显示SMC细胞核体积增大，细胞密度增加，骨架蛋白荧光强度增强，BDNF+K252a干预组细胞的形态改变相反;
　　5.BDNF组SMC中α-SMA蛋白表达水平明显高于对照组和BDNF+K252a组;
　　6.BDNF组结肠平滑肌细胞中TrkB-PLC-Ca2+信号通路蛋白表达水平明显升高，且在BDNF干预下SMC内钙离子浓度明显升高，K252a可阻断以上变化。
　　结论：
　　1.BDNF+/-小鼠与BDNF+/+小鼠相比，结肠平滑肌细胞的超微结构和功能均发生了改变。
　　2.小鼠原代结肠平滑肌细胞表达TrkB受体，且BDNF干预SMC后，小鼠结肠SMC的形态和功能均发生了改变，K252a可以阻断以上变化。
　　3.BDNF可能通过TrkB-PLC-Ca2+信号通路引起小鼠结肠平滑肌细胞的重构，进而影响肠道动力。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

1．实验动物和分组

2．实验材料和仪器

3．实验试剂

4．实验方法

3．统计学处理

实验结果

1．BDNF+／+小鼠BDNF+／-小鼠结肠平滑肌细胞超微结构的差异

2．BDNF+／-小鼠和BDNF+／+小鼠结肠组织α-SMA表达水平的差异

3．细胞免疫荧光鉴定结肠SMCs TrKB受体的表达

4．BDNF和K252a干预下结肠平滑肌细胞形态的改变

5．BDNF和K252a干预下结肠平滑肌细胞中α-SMA表达水平的变化

6．BDNF和K252a干预下SMC中TrkB信号通路蛋白表达水平的变化

7．BDNF和K252a干预下细胞内钙离子浓度的瞬时变化

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章