人乳寡糖LSTa和血清型5副猪嗜血杆菌荚膜多糖重复单元的化学酶法合成研究

摘要

本论文包括人乳寡糖LSTa和血清型5副猪嗜血杆菌荚膜多糖重复单元两类糖链的化学酶法合成研究。
　　1.人乳寡糖LSTa的化学酶法合成
　　人乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是天然存在于人乳中的一类由2-10个单糖分子组成的低聚糖，在母乳中的含量较高，仅次于乳糖和脂肪，尤其是在初乳中可达20-25 g/L。HMOs对婴儿消化系统的早期发育，及出生后免疫系统的完善和体内生态平衡的建立发挥着不可替代的作用，被誉为“第一益生元”。已有研究表明人乳寡糖的生物学功能包括维护肠道菌群平衡的益生元作用，抑制病原菌感染、病毒和肿瘤细胞的入侵，调节免疫反应和促进新生儿大脑的早期发育等，因而HMOs的生物学功能及其作用机制研究成为近年来糖领域的热点。
　　目前，已经确定的人乳寡糖的结构有100多种，它们有着共同的核心结构:乳-N-四糖(Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，LNT)。人乳寡糖的绝大部分组分都是以乳-N-四糖为核心结构，通过在其不同羟基上进行唾液酸化和（或）岩藻糖糖基化衍生而构成了人乳寡糖非常复杂的糖库。鉴于人乳寡糖重要的生物学意义，获得足够量结构均一的人乳寡糖单体来开展它们的生物学功能研究以及开发其在食品和医药领域的应用，如人工配方奶粉等方面的应用是现阶段迫切需要解决的问题。化学合成是获得结构确定寡糖的可靠方法，近年来陆续出现了一些关于乳-N-四糖化学合成的报道，但其步骤繁多，操作条件要求严格，并且总收率很低，难以达到大量合成并用于其生物学功能研究的目的。同时也出现了很多酶法，化学酶法及微生物代谢工程等合成方法，但是所需的酶大都来源于哺乳动物，存在表达量低、底物适应性窄、分离纯化复杂等问题，因此亟待发展一种实用、高效的乳-N-四糖的合成策略。本论文成功发展了一个来自于双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）的D-半乳糖-1-3-N-乙酰-D-己糖胺磷酸化酶(BiGalHexNAcP)和来自于大肠杆菌(E.coli)的重组半乳糖激酶(EcGalK)催化的一锅双酶反应策略来合成Galβ1-3GlcNAc二糖砌块。再将其与化学合成的乳糖苷通过化学糖苷化成功高效地合成了人乳寡糖的核心结构乳-N-四糖。乳-N-四糖作为底物可以进一步利用“一釜多酶”合成体系对其进行唾液酸化，成功合成了人乳中最常见的唾液酸化乳-N-四糖（Sialyllacto-N-tetraose a，LSTa）。乳-N-四糖作为核心结构和关键砌块还可以作为底物来合成其它众多唾液酸化或者岩藻糖化的人乳寡糖，这些工作还有待于今后进一步完善。
　　本研究取得的主要成果包括以下几方面:
　　(1)我们完成了乳糖苷受体的区域选择性保护，实现了汇聚糖苷化的高收率合成，为其他人乳寡糖的合成提供中间体和借鉴意义。
　　(2)我们运用“一锅双酶”法成功实现了人乳寡糖核心结构乳-N-四糖在克级水平上的快速、高效合成;所得的乳-N-四糖作为底物在“一锅三酶”催化体系下成功实现了唾液酸化乳-N-四糖(LSTa)的高效、大量合成;
　　(3)我们把化学修饰的底物应用于酶法合成，把酶法合成的砌块应用于化学合成，再把化学合成的砌块作为底物应用于酶法合成，充分应用了酶法合成高效性、选择性的优势又糅合化学合成的灵活性，实现了化学和酶法的高效、有机结合;
　　2.血清型5副猪嗜血杆菌荚膜多糖重复单元的化学酶法合成
　　副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是巴氏杆菌科嗜血杆菌属中一种没有运动性的小型多形态杆菌，革兰氏染色呈阴性，常可见荚膜。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的一种以纤维素性浆膜炎，多发性关节炎，胸膜炎和脑膜炎为特征的猪呼吸道传染病，严重危害各年龄段的猪群，病死率较高。近年来，该病成为危害全球养猪业的典型细菌性疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌血清型复杂多样，至少有15种血清型，不同血清型副猪嗜血杆菌之间的致病力差异较大。从世界范围内来看，血清4、5型最为流行，而Hps的毒力因子仍不清楚。Hps有荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)抗原和菌体结构抗原。荚膜抗原成分主要是多糖和磷壁酸，具有血清型特异性;菌体结构抗原包括外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)和脂多糖(LPS)。其中荚膜多糖和脂多糖在细菌感染寄主细胞时发挥重要的作用，虽然相关研究很多，但是具体的致病机制也还不清楚。
　　随着研究的发展，血清型5和15的荚膜多糖和脂多糖结构刚刚确定，特别是流行最广、毒性最强的血清型5荚膜多糖的结构研究吸引了人们极大的关注，期待对其潜在毒力因子的结构功能鉴定和致病机制提供基础导向性的理论研究。血清型5的荚膜多糖重复单元确定为Neu5Ac/Neu5Gcα2-3Galα1-P-6Glcβ1-3-Sugar(2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxy-D-galactopyranose)，该分子结构新颖、奇特，目前还没有相关的合成报道。我们从甘露糖通过多步反应首先得到细菌中普遍存在的脱氧糖受体，然后利用不同的葡萄糖苷给体根据不同的催化体系高效的合成目标四糖还原端的核心二糖砌块一。同时利用“一锅三酶”催化体系分别合成Neu5Acα2-3 Gal/Neu5 Gcα2-3 Gal，再经化学反应将其转化为非还原端修饰的二糖砌块二。将两个二糖砌块通过磷酸二酯键连接、再经脱保护成功得到了目标四糖重复单元。本研究为新型副猪嗜血杆菌高效广谱的疫苗研制奠定了一定的结构基础。
　　本研究取得的主要成果包括以下几方面:
　　(1)我们首次成功发展了一种化学酶法合成血清型5副猪嗜血杆菌荚膜多糖重复单元的方法，为研究副猪嗜血杆菌的毒力因子和致病机制提供了非常重要的活性体和结构功能研究的依据。
　　(2)我们首次化学酶法合成唾液酸和磷酸酯共存的罕见分子结构，该合成方法将成为未来类似寡糖合成工作中的一个强有力策略。
　　(3)我们首次化学合成了半乳糖通过磷酸酯连接葡萄糖6位的新颖寡糖分子。
　　(4)实现了多种葡萄糖苷给体和含双叠氮基团脱氧糖受体的多种有效结合的摸索和尝试。
　　(5)实现了细菌中常见脱氧糖的高效合成，为以后细菌中脱氧糖部分的化学修饰提供了有力的实验依据。
　　(6)我们利用“一锅多酶”体系解决了唾液酸合成在化学合成中的经典挑战，
　　并根据唾液酸5位基团的不同完成了分子多样性的合成。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 糖科学

第二节 糖化学

1 糖化学简述

2 糖合成概述

第三节 糖生物学与化学糖生物学

1 糖生物学

2 化学糖生物学

第二章 人乳寡糖LNT及其唾液酸化衍生物LSTa的化学酶法合成

第一节 人乳寡糖结构和功能概述

1 HMOs(Human milk oligosaccharides)简介

2 HMOs的结构

3 HMOs的生物学功能

第二节 人乳寡糖合成研究进展

1 化学合成

2 酶法合成

3 化学酶法合成

4 组合酶法和微生物工程合成

5 小结

第三节 人乳寡糖LNT及其唾液酸化衍生物LSTa的化学酶法合成

1 逆合成分析

2 人乳寡糖LNT及其唾液酸化衍生物LSTa的合成

第四节 实验部分

1 一般方法

2 实验过程

第五节 本章总结与展望

1 总结

2 展望

第三章 血清型5副猪嗜血杆菌荚膜多糖重复单元的化学酶法合成

第一节 副猪嗜血杆菌及其荚膜多糖概述

1 细菌荚膜多糖概述

2 副猪嗜血杆菌概述

3 副猪嗜血杆菌荚膜多糖概述

第二节 血清型5副猪嗜血杆菌荚膜多糖重复单元的化学酶法合成

1 逆合成分析

2 血清型5副猪嗜血杆菌荚膜多糖重复单元的合成

3 小结

第三节 实验部分

1 一般方法

2 实验过程

第四节 本章总结与展望

1 总结

2 展望

参考文献

附录

硕士期间发表的学术论文

致谢