丹毒丝菌表面保护抗原A作为重组亚单位疫苗和核酸疫苗的初步研究

摘要

[背景及目的]丹毒丝菌是猪丹毒和人类类丹毒症的致病菌，能够引起猪的急性或亚急性败血症和慢性的关节炎及心内膜炎，对其它许多家禽家畜也存在一定的危害，这给许多国家和地区的养殖业造成一定的经济损失，同时也对人类的健康构成一定的威胁。目前，尽管丹毒丝菌活菌疫苗、灭活疫苗和抗菌血清已经被广泛的应用于预防和治疗该菌引发的疾病，并在很大程度上能够避免急性猪丹毒的流行，但是它们的有效性通常依赖于动物对该疫苗的易感性，而母源抗体的存在使仔猪对现行活疫苗不敏感，最新研究也显示这类疫苗在预防慢性的猪丹毒方面效果并不理想，且在很大程度上增加了猪慢性关节炎的发病率，加上这些疫苗本身存在一定的变异性，所以开发新一代的高效、廉价、安全的疫苗显得尤为必要。本研究旨在利用分子生物学技术，以丹毒丝菌．spaA(surface protective antigen A)基因为候选基因探索开发新一代的预防由该菌引起的疾病的亚单位疫苗和核酸疫苗。 [方法]通过PCR方法从丹毒丝菌新疆分离株1249(Xj-1249)基因组扩增spaA基因N端免疫保护区片段(spaA-N)并在原核表达载体pGEX-4T-1中对该片段进行表达，通过GST Bind Resin纯化得到重组表达蛋白r-SpaA-N，用该重组蛋白在第0天、14天、28天对小鼠各皮下免疫一次，同时检测体内抗体水平变化情况，在小鼠末次免疫结束两周后分别对免疫组和对照组小鼠攻毒，菌量约为1.5×10<'5>，观察各组小鼠的攻毒结果并比较攻毒死亡小鼠和正常小鼠解剖后脏器之间的区别。另一方面，将扩增的丹毒丝菌的spaA基因构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)，得到重组真核质粒pcDNA3-spaA，经脂质体介导转染Hela细胞后通过RT-PCR方法确定该质粒在真核细胞转录水平上的表达，再用100μg的重组质粒pcDNA3-spaA和1％的盐酸左旋咪唑混合肌肉免疫昆明白小鼠，对照组免疫pcDNA3.1空载，检测该质粒在小鼠体内的免疫效果。 [结果](1)亚单位疫苗的研究：重组蛋白r-SpaA-N免疫组的攻毒实验显示所有小鼠都能够有效预防丹毒丝菌强毒株对小鼠的侵染，GST免疫组和生理盐水免疫组小鼠在腹腔注射丹毒丝菌后全部死亡，通过Western Blot和酶联免疫吸附实验(ELISA)在r-SpaA-N免疫组小鼠体内检测到抗SpaA—N的抗体，且抗体滴度高达1：150,000；(2)核酸疫苗的研究：成功构建得到针对丹毒丝菌的核酸疫苗pcDNA3-spaA，体外转染试验显示该质粒能够在mRNA水平表达，但对小鼠肌肉免疫该质粒后在体内检测不到针对SpaA蛋白的抗体。 [结论]原核表达的重组蛋白r-SpaA-N能够有效预防丹毒丝菌对小鼠的侵染，这显示了其在疫苗开发方面的潜在优势；构建的核酸疫苗pcDNA3-spaA只能在体外mRNA水平表达，却不能有效激发体内免疫反应，尚需进一步改善。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

第一部分文献综述

第二部分实验部分

第一章丹毒丝菌重组亚单位疫苗r-SpaA-N的制备

引言

1材料和主要试剂

2方法

3结果

4讨论

第二章丹毒丝菌重组亚单位疫苗r-SpaA-N的免疫保护性研究

引言

1材料和主要试剂

2方法

3结果

4讨论

第三章猪丹毒丝菌spaA作为基因疫苗的初步研究

引言

1材料和主要试剂

2方法

3结果

4讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历