缺锌对后代和成年大鼠BCG、ESAT-6/CFP-10免疫应答作用的初步研究

摘要

结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性传染病。据WHO统计，全世界约有20亿人感染结核分枝杆菌(MTB)。我国是结核病高负担国家之一，结核患者人数居世界第二位。结核病已成为当前威胁人类生命健康的严重传染性疾病。卡介苗(BCG)是目前世界上使用最广泛的疫苗，虽然被广泛用于结核病预防，但其效果仍不够满意。卡介苗可以预防并减轻儿童的严重结核病，有效率高达80％，但对成人的保护能力要弱得多。前期的研究也发现，在成人和老人中，BCG对肺结核预防的有效性是极不确定的。
　　近年来研究发现，缺锌的地区结核病的发病率较高，肺结核患者的血清锌水平比正常人低，这一现象引起本研究小组的兴趣，推测锌可能与结核病有一定的关联。锌对人类免疫功能的多个方面产生影响。锌在体内的吸收、分布和代谢都与锌转运体密不可分，其中锌转运体ZIP2和ZIP8与感染炎症有一定的相关性。
　　早期分泌抗原靶蛋白6（Early secretory antigen target-6，ESAT-6）和培养滤液蛋白10(Culture filtrate protein10，CFP-10)仅存在于致病性结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，能诱导有效的Th1应答，并具有对肺结核的特异性保护力，已经成为肺结核免疫诊断和疫苗研究中最有力的候选抗原之一。
　　第一部分 缺锌对后代和成年大鼠BCG、ESAT-6/CFP-10免疫应答的影响
　　目的:
　　通过在孕期、幼年期或成年期用正常或缺锌饲料喂养大鼠，在不同时间免疫动物，探讨缺锌和疫苗接种时间对BCG和ESAT-6/CFP-10免疫应答作用的影响。
　　方法:
　　在确认怀孕的当天，将32只怀孕的Wistar大鼠随机分为两组:正常组(NC)和缺锌组(ZnD)。孕期正常组大鼠给予正常饮食（饲料锌含量30mg/kg）;缺锌组大鼠给予缺锌饮食(饲料锌含量8mg/kg)。孕鼠所生的后代鼠作为实验对象。
　　将32只10周龄的雄性Wistar大鼠随机分为两组:正常组(NC)和缺锌组(ZnD)。正常组大鼠每天给予正常含锌饮食(饲料锌含量30mg/kg);缺锌组大鼠每天给予缺锌饮食(饲料锌含量8mg/kg)，持续喂养17周。
　　后代鼠出生的第0和第2周、成年大鼠喂养的第12和14周，分别用BCG或ESAT-6/CFP-10免疫大鼠。第二次疫苗接种3周后将动物处死，进行免疫检测。
　　结果:
　　1.BCG和ESAT-6/CFP-10缺锌大鼠血浆锌离子含量、INF-γ、TNF-α表达低于正常组。缺锌幼年大鼠脏器系数、淋巴细胞增殖能力明显低于正常组。缺锌大鼠免疫器官ZIP2、ZIP8、NF-κB和IL-6 mRNA表达发生改变。
　　2.正常成年大鼠血淋巴细胞ZIP2和ZIP8 mRNA低于正常幼年大鼠;正常成年大鼠的血淋巴细胞、脾脏中NF-κB mRNA的低于正常幼年大鼠;正常幼年大鼠IL-6 mRNA高于正常成年大鼠。
　　3.正常BCG幼年大鼠胸腺和脾脏ZIP2、ZIP8 mRNA高于正常ESAT-6/CFP-10大鼠。正常BCG幼年大鼠血淋巴细胞和脾脏NF-κB mRNA高于正常ESAT-6/CFP-10大鼠。IL-6 mRNA在缺锌BCG幼年大鼠血淋巴细胞和脾脏中比缺锌ESAT-6/CFP-10大鼠有较高表达，在正常BCG幼年大鼠脾脏中比正常ESAT-6/CFP-10大鼠有较高表达。
　　结论:
　　缺锌降低机体对BCG、ESAT-6/CFP-10的免疫作用。BCG的接种时间可能对免疫应答有一定影响。ESAT-6/CFP-10可能在提高大鼠的免疫力方面有一定作用。
　　第二部分 锌对A-549细胞锌转运体基因表达以及对ESAT-6/CFP-10免疫应答作用的影响
　　目的:
　　缺、加锌处理A-549细胞，探讨低锌和高锌处理对细胞锌转运体表达以及对ESAT-6/CFP-10免疫应答作用的影响。
　　方法:
　　1.缺锌、高锌处理，24h后收集细胞。
　　2.A-549细胞缺、加锌处理24h后，各梯度分别加入ESAT6/CFP-1010μl/ml，刺激24h后收集细胞。
　　3.ZIP8、NF-κB过表达质粒转染A-549细胞，转染24小时后加入ESAT-6/CFP-1010μl/ml，刺激24h后收集细胞。
　　结果:
　　1.低浓度ZnCl2和TPEN对A-549细胞生长均有明显的抑制作用。
　　2.高锌时，ZIP2、ZIP8和NF-κB mRNA表达先降低后升高;缺锌时，ZIP2 mRNA的表达先升高后降低，ZIP8和NF-κB mRNA的表达先降低后升高。
　　3.抗原刺激时，ZIP8 mRNA高锌时显著上升，低锌时显著降低。高锌时，NF-κBmRNA表达下降;ZIP2 mRNA表达先上升后下降。低锌条件下，ZIP2 mRNA表达下降;NF-κB mRNA表达先升高后降低。
　　4.抗原刺激同时NF-κB过表达，ZIP2 mRNA表达降低，ZIP8 mRNA和蛋白表达显著增加。
　　结论:
　　高锌和低锌对A-549细胞的生长都有抑制作用。高、低锌可以改变细胞ZIP2、ZIP8和NF-κB mRNA的表达。高、低锌以及ZIP8、NF-κB过表达的情况下，细胞对ESAT-6/CFP-10的免疫应答作用都有一定的差异。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和设备

实验一 缺锌对后代和成年大鼠BCG、ESAT-6／CFP-10免疫应答的影响

方法

结果

讨论

实验二 锌对A-549细胞锌转运体基因表达以及对ESAT-6／CFP-10免疫应答作用的影响

方法

结果

讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文