罗勒多糖及姜黄素差异性影响人卵巢癌SKOV3细胞及DCs迁移的研究

摘要

研究目的：
　　分析研究罗勒多糖及姜黄素对卵巢癌SKOV3细胞迁移活性的影响及机制，同时观察两种药物对人外周血来源树突状细胞(dendritic cells，DCs)分化及迁移能力的影响。以期为筛选差异调控肿瘤细胞及免疫细胞迁移活性的制剂提供数据依据。
　　研究方法：
　　1.人外周血来源DCs的培养
　　免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞，置于RPMI1640培养液中，与1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4联合培养5天后形成未成熟DCs(imDCs)，第5天时加入1μg/ml LPS诱导促使DC成熟分化为成熟DCs(mDCs)，培养过程中观察细胞形态，流式细胞仪检测分别测定mDCs及imDCs细胞表面标志物以明确其表型。
　　2.罗勒多糖及姜黄素对人外周血来源DCs成熟的影响
　　将罗勒多糖和姜黄素、LPS分别加入imDCs中，分为imDCs组、imDCs+姜黄素组、imDCs+LPS组、imDCs+LPS+姜黄素组、imDCs+罗勒多糖组、imDCs+LPS+罗勒多糖组，流式细胞仪检测细胞表面标志物及吞噬功能，ELISA法检测DCsIL-12分泌水平，探讨罗勒多糖和姜黄素对DCs发育影响的差异性。
　　3.罗勒多糖和姜黄素对卵巢癌细胞株SKOV3和人外周血来源DCs迁移活性的影响
　　Transwell试验分析罗勒多糖和姜黄素对SKOV3细胞和人外周血来源DCs迁移能力的影响;酶联免疫吸附试验测定罗勒多糖和姜黄素处理后SKOV3细胞和人外周血来源DCs中MMP-9及OPN含量;Western-blot法和实时定量PCR分析罗勒多糖和姜黄素处理后SKOV3细胞和人外周血来源DCs中OPN蛋白及mRNA表达水平;流式细胞术检测罗勒多糖和姜黄素处理后SKOV3细胞和人外周血来源DCs中CD44表达。
　　研究结果：
　　1.人外周血单核细胞中CD14+细胞经GM-CSF和IL-4诱导后获得imDCs，流式细胞仪检测DCs表型结果显示，经GM-CSF和IL-4诱导获得的imDCs可见CD1a、CD209阳性表达，CD80、CD86及HLA-DR低表达，CD14和CD83不表达;LPS刺激后获得DCs可见CD1a、CD209、CD83、CD86及HLA-DR阳性表达，提示DCs已发育至成熟状态。
　　2.imDCs培养至第5天时，分别加入100μg/ml的罗勒多糖(BPS)或50μM姜黄素(Cur)与LPS(1μg/ml)继续培养24 h，imDCs+Cur组和imDC+LPS+Cur组中CD80、CD83、CD86、HLA-DR阳性率与imDC组相比未发生明显变化;与单纯LPS刺激组相比，imDCs+LPS+Cur组中CD80、CD83、CD86、HLA-DR阳性比例明显降低(p＜0.05)，其值分别为（36.9±2.7）％，（5.0±0.4）％、（29.1±1.8）％和（35.6±1.7）％，提示Cur可拮抗LPS促DCs成熟作用;LPS和BPS单独处理组可见DCs表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达阳性率升高(p＜0.05)，且二者的作用效果相当，提示BPS可促DCs表面标志物的表达。
　　2.imDC分别加入LPS、100μg/ml的罗勒多糖(BPS)或50μM姜黄素(Cur)处理后，流式细胞仪检测DCs吞噬FITC-葡聚糖能力。与imDCs组相比，LPS刺激后mDCs的吞噬能力明显降低(p＜0.05)，仅为（12.5±2.1）％;单独给予Cur干预后DCs的FITC-葡聚糖摄取能力未发生明显变化;与LPS单独刺激组相比，imDCs+LPS+Cur组摄取葡萄糖阳性细胞比为（24.8±3.7）％，明显高于imDCs+LPS组(p＜0.05)，提示姜黄素可抑制LPS促DCs成熟作用;imDCs给予BPS干预后，流式细胞仪测定DCs摄取葡萄糖阳性细胞率为（20.2±2.8）％，与imDCs组相比其吞噬能力显著降低(p＜0.05)，其效果与单独LPS刺激组相当，提示BPS具有与LPS相似的促DCs成熟作用。
　　3.ELISA法测定罗勒多糖(BPS)或姜黄素(Cur)处理后DCs培养液上清中IL-12水平，imDCs组培养液上清中IL-12含量为72.47±4.51 pg/ml，经LPS刺激后其含量增加至197.63±13.22 pg/ml(p＜0.05)，提示LPS可增强DCs IL-12的分泌能力;单独给予Cur干预后DCs IL-12分泌水平与imDCs组相比无明显变化;与LPS单独刺激组相比，imDCs+LPS+Cur组DCs培养上清中IL-12含量显著降低(p＜0.05)，其值为95.47±8.99 pg/ml; imDCs给予BPS干预后，DCs IL-12分泌水平可达143.51±9.92 pg/ml，明显高于imDCs组，表明BPS可增强DCs IL-12分泌能力。
　　4.卵巢癌细胞株SKOV3和DCs分别经100μg/ml的罗勒多糖(BPS)或50μM姜黄素(Cur)处理，Transwell试验结果表明姜黄素及罗勒多糖均可显著抑制SKOV3细胞的体外迁移活性(p＜0.05)，二者抑制效率无明显差别;与对照组相比，50μM姜黄素处理组imDCs和mDCs迁移的细胞数目明显降低(p＜0.05)，100μg/ml罗勒多糖处理内imDCs和mDCs迁移细胞数目与对照组相比无明显变化。
　　5.卵巢癌细胞株SKOV3和DCs分别经100μg/ml的罗勒多糖(BPS)或50μM姜黄素(Cur)处理，ELISA法测定细胞培养上清液中MMP-9含量，Cur组和BPS处理组SKOV3细胞培养上清液中MMP-9的含量分别为17.46±2.56 pg/ml和14.89±1.23 pg/ml，与对照组相比，罗勒多糖和姜黄素处理组SKOV3细胞培养上清液中MMP-9含量显著降低(p＜0.05);imDCs及mDCs经BPS或Cur处理后，BPS处理组imDCs及mDCs培养上清中MMP-9的含量分别为22.63±5.72pg/ml和32.94±7.89 pg/ml，与对照组相比无明显差异。Cur处理组中imDCs及mDCs MMP-9的分泌分别为10.03±1.64 pg/ml和12.15±1.91 pg/ml，与对照组相比显著降低(P＜0.05)，提示Cur可影响imDCs及mDCs MMP-9的分泌能力。实时荧光定量PCR法分析SKOV3细胞、imDCs及mDCs经Cur和BPS处理后MMP-9 mRNA表达水平，Cur处理组SKOV3、imDCs及mDCs MMP-9 mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)，其变化趋势与imDCs及mDCs培养上清中MMP-9含量变化相一致。与对照组相比，BPS处理组imDC及mDC MMP-9 mRNA表达水平未发生明显改变。
　　5.100μg/ml的罗勒多糖(BPS)或50μM姜黄素(Cur)处理与SKOV3细胞与DCs共培养24 h后，Cur和BPS处理组SKOV3细胞培养上清液中OPN含量分别为432.98±32.97 pg/ml和614.90±51.22 pg/ml，与对照组相比，Cur和BPS处理组SKOV3细胞培养上清液中OPN含量显著降低(P＜0.05);BPS处理组imDCs及mDCs培养上清中OPN含量分别为2397.65±170.92 pg/ml和2863.64±132.91 pg/ml，与对照组相比无显著差异。与Cur共同培养后，imDCs及mDCs培养上清中OPN含量分别降至1123.61±89.64 pg/ml和1483.34±99.84 pg/ml(P＜0.05)，提示Cur可抑制imDCs及mDCs OPN的分泌。Western-blot分析分析SKOV3细胞、imDCs及mDCs经Cur和BPS处理后OPN蛋白表达情况，Cur处理组SKOV3、imDCs及mDCs OPN蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)，其变化趋势与imDCs及mDCs培养上清中OPN含量变化相一致。与对照组相比，BPS处理组imDC及mDC OPN蛋白表达水平未发生明显改变。
　　7.流式细胞仪分析SKOV3、imDCs及mDCs经罗勒多糖(BPS)和姜黄素(Cur)处理后细胞表面CD44表达，Cur处理组SKOV3、imDCs及mDCs表面CD44表达明显低于BPS处理组。
　　结论：
　　1.罗勒多糖和姜黄素均可显著抑制卵巢癌SKOV3细胞迁移，并通过相似的机制OPN/MMP-9或OPN/CD44/MMP-9途径抑制卵巢癌SKOV3细胞的迁移活性。罗勒多糖不影响SKOV3细胞CD44的表达，推测其可能通过其他机制如OPN的其他受体发挥相应的抑制迁移效应。
　　2.罗勒多糖与姜黄素对人外周血来源DCs的分化成熟影响不同，罗勒多糖促进DCs发育与成熟，而姜黄素则抑制DCs的成熟。
　　3.罗勒多糖与姜黄素对人外周血来源DCs的迁移活性影响不同，罗勒多糖不影响DCs迁移，但姜黄素可显著影响其体外迁移能力。
　　4.与姜黄素不同，罗勒多糖在抑制卵巢癌细胞SKOV3迁移能力的同时不影响DCs的迁移，并能促进DCs的成熟。因此，罗勒多糖是更为理想的抗肿瘤转移制剂的候选制剂。
　　创新性：
　　1.发现并阐述了罗勒多糖及姜黄素对卵巢癌细胞系SKOV3迁移活性的影响及机制，罗勒多糖虽也可通过影响OPN及MMP9通路抑制SKOV3细胞的迁移，但与姜黄素可能利用不同的OPN配体。
　　2.首次发现罗勒多糖与姜黄素对人外周血来源DCs分化成熟影响的差异性，体外实验证明，罗勒多糖在抑制肿瘤细胞的迁移活性的同时还能促进DCs成熟。
　　3.首次发现罗勒多糖与姜黄素对人外周血来源DCs迁移活性影响的差异，体外实验证实，罗勒多糖在抑制肿瘤细胞迁移活性的同时不影响DCs的迁移活性，提示罗勒多糖可能是更为有效的抗肿瘤转移制剂的候选药物。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 罗勒多糖及姜黄素对DCs成熟的影响

1 试剂与材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

6 图表

第二部分 罗勒多糖及姜黄素对DCs迁移功能的影响及机制研究

1 试剂与材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

6 图表

第三部分 罗勒多糖及姜黄素对卵巢癌细胞株SKOV3迁移功能的影响及机制研究

1 试剂与材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

6 图表

结论

创新性

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文

外文论文1

外文论文2