影像学联合IGF-1诊断女童性早熟及IGF-1参与调控GnRH分泌的机制研究

摘要

儿童性早熟作为常见的儿科内分泌疾病，患儿多表现出与其实际年龄不相符的性特征发育。本研究首先对比了中枢性性早熟和不完全性性早熟患儿外周血中促性腺激素含量、性激素水平、子宫和卵巢B超诊断结果，探讨了二者在检测结果上的差异性，旨在为今后中枢性性早熟和不完全性性早熟的临床诊断提供可靠依据。其次，通过体外实验探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）是否通过PI3K/AKT（蛋白激酶B）介导作用影响KISS1/GPR54表达进而实现对促性腺激素释放激素(GnRH)脉冲分泌的调控，为今后IGF-1的基础研究和临床应用提供实验依据。最后，分析两组患儿外周血的IGF-1水平与影像学指标等的相关性，表明影像学联合IGF-1在儿童性早熟疾病诊断中具有重要的临床应用价值。
　　研究目的：
　　明确CPP和IPP患儿骨龄、超声诊断、性激素及IGF-1检测指标的差异;探讨IGF-1对KISS1/GPR54表达影响及可能机制;分析CPP和IPP患儿IGF-1水平与影像学指标及性激素指标的相关性。
　　研究方法：
　　1.收集2013年-2015年就诊于我院儿科内分泌门诊的具有完整资料的CPP及IPP女童各40例作为研究对象。CPP组患儿初诊时平均年龄为1～11岁，平均年龄（7.75±2.43）岁，IPP组患儿初诊时年龄为2～9岁，平均年龄为（7.50±1.64）岁，所有患儿经详细询问病史、体格检查、子宫卵巢B超扫描、骨龄检查、测定性激素及IGF-1水平，所有患者均知情并签署知情同意书。
　　2.分析比较CPP和IPP患儿骨龄、超声诊断、性激素及IGF-1检测指标的差异。
　　3.分离培养SD乳鼠下丘脑神经元，分别给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预2h，4h，6h及24 h后，放免法检测不同处理时间下SD乳鼠下丘脑神经元培养上清液中GnRH含量，明确最佳的作用时间;实时荧光定量PCR测定IGF-1干预后下丘脑神经元KISS1、GPR54及GnRH mRNA表达水平，western blot检测IGF-1干预后下丘脑神经元AKT及p-AKT蛋白表达水平;使用PI3K抑制剂LY294002预处理30 min后，在培养液上清中加入10 ng/ml IGF-1处理4h，实时荧光定量PCR分析下丘脑神经元KISS1、GPR54 mRNA表达水平。
　　4.分析CPP和IPP患儿IGF-1水平与影像学指标及性激素指标的相关性。
　　研究结果：
　　1.CPP及IPP患儿临床指标差异性分析
　　1) CPP组患儿的平均骨龄为（9.19±2.73）岁，骨龄范围为2～12岁，与实际年龄相比，骨龄明显偏大(P＜0.05)，二者之差为1.70岁，符合中枢性性早熟诊断标准中骨龄应大于实际年龄1岁以上的要求。IPP组患儿平均骨龄为(8.08±1.97)岁，骨龄范围为1.5～9岁，与实际年龄之差为0.52岁，基本与实际年龄相符合。对比CPP组与IPP组患儿的骨龄，可见CPP组患儿的骨龄明显高于IPP组(P＜0.05)。骨龄指数计算公式=骨龄/实际年龄，CPP组和IPP组骨龄指数计算结果分别为1.25±0.26和1.07±0.23，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2) CPP组患儿子宫容积和宫颈长度分别为2.90±2.99 ml和1.76±0.26 cm，IPP组患儿子宫容积和宫颈长度为1.52±0.94 ml和1.78±0.61cm，对比两组数据可见CPP患儿子宫容积明显高于IPP组(P＜0.05)，但宫颈长度两组间无明显差异;对比两组患儿卵巢超声诊断指标，在卵巢容积方面CPP组与IPP组患儿而没有明显的差别，但CPP组患儿卵巢中卵泡最大直径为0.59±0.23 cm，明显高于IPP组(P＜0.05)，且CPP组直径大于0.4 cm卵泡个数为3.63±2.35个，而IPP组患儿直径大于0.4 cm卵泡个数为2.34±1.38个，与CPP组相比，IPP组患儿卵巢中直径大于0.4 cm卵泡个数明显减少(P＜0.05)。上述结果表明与IPP患儿相比，CPP患儿的子宫容积及卵巢中最大卵泡直径明显增加，直径大于0.4 cm卵泡个数显著增多，提示CPP患儿子宫及卵巢成熟度高于IPP患儿。
　　3) CPP及IPP患儿血清中FSH含量分别为5.04±4.17 IU/L和1.30±0.48 IU/L，LH含量为1.97±2.49 IU/L和0.50±0.32 IU/L，E2含量分别为24.32±26.92 pg/ml和13.06±8.49pg/ml，T含量分别为0.18±0.19 ng/ml和0.09±0.10pg/ml，CPP组患儿血清中FSH、LH、E2和T的水平明显高于IPP组，差异有统计学意义(P＜0.05);以上结果提示CPP患儿性腺轴活化程度较高。
　　4) CPP组和IPP组患儿血清中IGF-1含量分别为318.94±155.81 ng/ml和191.46±107.89 ng/ml，CPP组患儿IGF-1含量明显高于IPP组。
　　2.IGF-1对SD幼鼠下丘脑神经元原代细胞KISS1/GPR54表达影响及机制研究
　　1) SD乳鼠下丘脑神经元给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预2h后，培养上清液中GnRH含量分别为13.63±3.56 pg/ml和19.17±3.12 pg/ml，表明IGF-1干预2h后培养上清中GnRH含量即开始增加(p＜0.05);培养4h后，IGF-1干预组GnRH含量继续增加，提示IGF-1可增强SD乳鼠下丘脑神经元GnRH分泌能力;培养6h后，10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预组培养上清液中GnRH含量均出现不同程度的降低，此时10 ng/ml IGF-1干预组中GnRH含量已与对照组水平相当;24h后IGF-1干预组培养上清液中GnRH含量继续降低，尤其是100ng/ml IGF-1干预组，其培养上清液中GnRH含量为8.79±2.07pg/ml，明显低于对照组(p＜0.05)，上述结果表明，经不同浓度IGF-1处理后，SD乳鼠下丘脑神经元培养上清液GnRH含量呈现先升高后下降的趋势，IGF-1干预4h时上清液中GnRH水平达到峰值随后进入下降阶段，因此在后续研究我们设置4h作为实验干预时间。
　　2)给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预4h后，SD乳鼠下丘脑神经元KISS1及GPR54 mRNA表达水平均显著升高(p＜0.05)，且存在剂量依赖性，提示IGF-1可上调下丘脑神经元KISS1和GPR54 mRNA表达。
　　3)给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预4h后，SD乳鼠下丘脑神经元GnRHmRNA表达水平表现为不同程度的升高，且与对照组存在显著性差异(p＜0.05)，其改变情况与培养上清中GnRH分泌水平变化相一致。
　　4)给予10 ng/ml和100 ng/ml IGF-1干预4h后，Western-blot法测定下丘脑神经元AKT及p-AKT蛋白表达，可见与对照组相比，IGF-1干预组AKT蛋白表达水平未发生明显改变，但IGF-1可显著上调下丘脑神经元p-AKT蛋白表达水平(p＜0.05)，提示IGF-1可激活PI3K-AKT信号通路。
　　5)经LY294002预处理后，给予10 ng/ml IGF-1干预4h，可见下丘脑神经元p-AKT蛋白表达水平明显降低(p＜0.05)。
　　6)LY294002预处理可使IGF-1干预组中下丘脑神经元KISS1和GPR54 mRNA表达水平下调，提示LY294002可拮抗IGF-1对KISS1/GPR54 mRNA的促表达作用。
　　3.CPP及IPP患儿血清IGF-1水平与骨龄、超声及性激素指标相关性分析
　　1) CPP和IPP组患儿血清中IGF-1水平与骨龄指数呈明显相关性。
　　2) CPP组患儿血清中IGF-1含量与子宫容积、卵巢体积及卵泡数目呈显著正相关性(P＜0.05);IPP组患儿血清中IGF-1含量与子宫容积、卵巢体积及卵泡数目无明显相关性。
　　3) CPP组患儿血清中IGF-1含量与LH、E2、及T呈显著正相关性(P＜0.05)，与FSH、PRL、PRG无明显相关性;IPP组患儿血清中IGF-1含量与T呈显著正相关性(P＜0.05)，与FSH、LH、E2、PRL、PRG无明显相关性。
　　结论：
　　1)CPP患儿骨龄指数大于IPP患儿组，在超声指标方面，CPP患儿子宫体积、最大卵泡直径及直径＞0.4 cm卵泡数目均明显高于IPP患儿组，提示骨龄及超声检查在中枢性性早熟和不完全性性早熟的鉴别诊断中有较高的应用价值;CPP患儿外周血中FSH、LH、E2、T及IGF-1水平均高于IPP患儿组，性激素及IGF-1可作为辅助指标用于中枢性性早熟和不完全性性早熟的鉴别诊断。
　　2)IGF-1可通过激活PI3K/AKT信号上调SD乳鼠下丘脑神经元KISS1和GPR45 mRNA表达水平。
　　3) IGF-1与CPP患儿性激素、性腺发育表现为正相关性，表明IGF-1参与调控青春期启动发生。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 中枢性性早熟和不完全性性早熟临床诊断指标的差异性探讨

1 研究对象

2 研究方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

6 附图表

第二部分 IGF-1对SD乳鼠下丘脑神经元原代细胞KISS1/GPR54表达影响及机制研究

1 试剂与材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

6 附图表

第三部分 中枢性性早熟和不完全性性早熟临床诊断指标与IGF-1水平的相关性分析

1 研究对象

2 研究方法

3 结果

4 讨论

5 结论

6 附图表

综述 儿童性早熟的诊断进展及机制研究

参考文献

致谢

攻读博士学位期发表论文及获奖情况

学位论文评阅及答辩情况表

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