缺氧诱导因子-1α相关分子影响动脉粥样硬化斑块形成及稳定性的机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　论文Ⅰ 脯氨酸羟化酶3对动脉粥样硬化斑块形成的影响及其相关机制研究
　　目的:
　　1.通过对ApoE-/-小鼠转染携带PHD3的慢病毒，探究PHD3对AS斑块形成的影响;
　　2.探究PHD3对AS斑块内脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞及胶原的影响;
　　3.通过体内外实验探究PHD3对内皮细胞的影响及其相关信号通路;
　　方法:
　　1.构建动脉粥样硬化动物模型
　　将100只6-8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为5组（每组20只），分别为普通饮食组（control组）、高脂组（HFD组）、PHD3高表达慢病毒干预组（lv-PHD3组）、PHD3-shRNA干预组（Sh-PHD3组）和慢病毒空载体干预组(NC组)。适应性喂养1周后，对lv-PHD3组、sh-PHD3组和NC组小鼠分别注射PHD3-1entivirus慢病毒、PHD3-shRNA慢病毒和空载体慢病毒（2×107TU/只）。转染2周后取材，制备冰冻切片，检测病毒转染效率。喂养12周后，小鼠预先禁食12小时后称重，用0.8％戊巴比妥腹腔注射麻醉，心脏取血，离心后取上清保存于-80度冰箱。用生理盐水冲洗小鼠的心脏和主动脉，防止血液残留。部分小鼠继以4％多聚甲醛进行内固定。剥离小鼠心脏和主动脉，部分放入4％多聚甲醛固定，其余动物标本保存于-80度冰箱。
　　2.主动脉表面AS病变染色
　　将浸泡于4％多聚甲醛中的组织取出，从主动脉弓到腹主动脉分叉处剥离周围结缔组织成分，延主动脉小弯一侧剖开组织并展开固定于蜡板上，用油红O染液染色30分钟，红色区域为被染色的AS斑块。AS的病变严重程度用斑块占整个主动脉表面积的百分比表示。
　　3.主动脉根部AS病灶分析
　　以6μm的厚度连续切小鼠主动脉根部，做平行于瓣环的冰冻切片，后对斑块内结构和成分进行染色，如苏木素-伊红染色和油红O染色，以此分析主动脉根部的形态及检测主动脉根部的斑块面积。病变的严重程度用总斑块面积占整个瓣环面积的比例表示。
　　结果:
　　1.各组小鼠的一般情况
　　在处死动物前，对高脂组、lv-PHD3组、sh-PHD3组及NC组中小鼠的体重、血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平进行检测，结果显示以上指标在各组中并不存在浓度差异(P＞0.05)。这表明PHD3病毒转染并不影响小鼠体内整体的脂质代谢。
　　2.慢病毒转染后PHD3在动脉粥样硬化斑块中的表达
　　免疫组化结果显示，与control组对比，HFD组斑块中PHD3表达升高(P＜0.05)。与NC组对比，PHD3 lentivirus转染组小鼠斑块中PHD3表达显著增高，而PHD3-shRNA慢病毒转染组小鼠斑块中PHD3显著减少（P均＜0.05）。Western blot结果与免疫组化结果一致。这一结果表明，PHD3病毒可有效干预小鼠主动脉根部斑块中PHD3的表达。
　　3.PHD3慢病毒转染后对主动脉斑块内脂质聚集的影响
　　小鼠主动脉大体油红O染色显示，HFD组较control组斑块面积显著增加(P＜0.05);与NC组比较，lv-PHD3组斑块面积显著增加(P＜0.05)，而sh-PHD3组斑块面积明显减少(P＜0.05)。主动脉根部横切面油红O染色结果与大体油红O染色结果一致。以上结果表明，PHD3过表达可增加小鼠主动脉斑块内脂质的积聚，而抑制PHD3后斑块内脂质积聚减少。
　　结论:
　　1.PHD3过表达慢病毒转染可加速AS斑块的形成，而抑制PHD3则可减少斑块的形成;
　　2.PHD3通过增加动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞浸润和平滑肌细胞迁移促进动脉粥样硬化的形成;
　　3.PHD3过表达慢病毒转染可促进AS斑块内VCAM-1和ICAM-1的表达;
　　4.MAPK信号通路介导了PHD3对内皮细胞的影响。
　　论文Ⅱ 内脏脂肪素对斑块稳定性的影响及其机制研究
　　目的：
　　1.通过visfatin慢病毒转染，明确visfatin高表达对AS斑块稳定性的影响
　　2.探讨visfatin慢病毒转染对AS斑块内巨噬细胞、脂质积聚、平滑肌细胞以及胶原纤维的影响;
　　3.探讨visfatin促进AS斑块中MMP-8表达的相关信号通路。
　　方法：
　　1.构建动物模型
　　80只6周龄雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养2周后，对小鼠行颈动脉套管，套管位置在左颈总动脉处。继续高脂喂养8周后，随机将小鼠分为2组（每组40只），分别为lenti-visfatin组和lenti-null组。Lenti-visfatin组给予1×107 TUvisfatin高表达慢病毒局部浸润，lenti-null组给予1×107 TU空载体病毒局部浸润。继续喂养4周后，小鼠预先禁食12小时后称重，用0.8％戊巴比妥腹腔注射麻醉，心脏取血，离心后取上清保存于-80度冰箱。用生理盐水冲洗小鼠的心脏和主动脉，防止血液残留。部分小鼠继以4％多聚甲醛进行内固定。剥离小鼠颈动脉，部分放入4％多聚甲醛固定，其余动物标本保存于-80度冰箱。
　　2.血清学检测
　　检测小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。
　　3.颈动脉油红O染色
　　以6μm的厚度连续切小鼠颈动脉，并进行油红O染色，以此分析颈动脉处斑块内脂质的聚集。病变的严重程度用油红O阳性染色区域面积占整个颈动脉面积的比例表示。
　　结果:
　　1.小鼠的体重及血清学检测指标
　　lenti-null组和lenti-visfatin组小鼠在血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平不存在显著性差异(P＞0.05)，表明lenti-visfatin的局部转染并不影响小鼠体内脂质代谢水平。
　　2.Visfatin慢病毒转染后在颈动脉斑块内表达的检测
　　在转染后的第3天，组织内mRNA水平明显升高(P＜0.05)，而蛋白水平却无明显变化(P＞0.05)。转染后第7天，组织内mRNA水平和蛋白水平均明显升高(P＜0.05)。4周后，lenti-visfatin组中visfatin的表达仍然显著高于lenti-null组(P＜0.05)。以上结果表明，visfatin慢病毒转染成功上调了小鼠颈动脉组织中visfatin的表达。
　　3.Visfatin在颈动脉斑块内主要表达于单核-巨噬细胞
　　visfatin和巨噬细胞免疫荧光共定位结果显示，在颈动脉斑块内，visfatin的绿色荧光与巨噬细胞的红色荧光存在高度重合区域，而在非MOMA-2阳性区域也存在少量绿色荧光，表明visfatin主要来源于斑块内的巨噬细胞，少量表达于其他细胞中。
　　4.Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内巨噬细胞的影响
　　对小鼠颈动脉冰冻切片行MOMA-2染色。结果显示，lenti-visfatin组与lenti-null组相比，巨噬细胞占斑块面积的比例显著增加(P＜0.05)，表明visfatin高表达可使小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞的聚集明显增加。
　　5.Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内脂质聚集的影响对小鼠颈动脉冰冻切片行油红O染色，检测颈动脉斑块内脂质的聚集情况。结果发现，lenti-visfatin组与lenti-null组相比，脂质占颈动脉斑块面积的比例明显升高（P＜0.05=，说明visfatin高表达可使小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞的聚集明显增加。
　　6.Visfatin高表达慢病毒转染对颈动脉斑块内平滑肌细胞的影响
　　对小鼠颈动脉冰冻切片行α-SMA染色，检测斑块内平滑肌细胞的聚集情况。结果发现，lenti-visfatin组与lenti-null组相比，平滑肌细胞占颈动脉斑块的面积明显减少（P＜0.05=，表明visfatin高表达可使小鼠颈动脉斑块内平滑肌细胞数目减少。
　　结论:
　　1.visfatin与实验性小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性密切相关;
　　2.visfatin慢病毒转染可显著降低AS斑块的稳定性;
　　3.visfatin可促进MMP-1、2、8、9的表达，且呈剂量和时间依赖性;
　　4.visfatin通过NF-κB途径促进MMP-8的表达。

目录

声明

论文Ⅰ 脯氨酸羟化酶3对动脉粥样硬化斑块形成的影响及其相关机制研究

摘要

符号说明

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附表

附图

参考文献

论文Ⅱ 内脏脂肪素对斑块稳定性的影响及其机制研究

摘要

符号说明

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4．结论

附图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间科研情况

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