ORMDL3通过促进B细胞自噬参与系统性红斑狼疮发生的作用机制研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 Ormdl3基因敲除小鼠及Pristane诱导狼疮小鼠模型的构建及表型分析
　　为了明确ORMDL3对免疫系统的影响，探究在缺乏Ormdl3的情况下是否会影响小鼠的生长发育状况，构建了Ormdl3基因敲除小鼠模型。
　　最终证实该小鼠具有较好的Ormdl3基因敲除效率。通过对敲除小鼠及对照小鼠体重和脾脏的称重后，发现两种基因型小鼠体重并无明显差异，但敲除小鼠脾脏大小及重量显著低于野生小鼠（P＜0.01），因此脾重与体重比显著降低（P＜0.05）。接着，对该批小鼠脾脏及肺脏组织进行了H&E染色，结果显示相比野生小鼠，Ormdl3基因敲除小鼠肺脏组织结构正常，但脾脏内白髓面积略有缩小，白髓与红髓比例降低，这可能是造成敲除小鼠脾脏缩小的原因。
　　为了分析Ormdl3对免疫系统的作用，接下来我们在体内就Ormdl3对免疫器官B和T淋巴细胞发育的影响进行了重点研究。通过流式细胞仪对6-24周龄不同年龄阶段成年Ormdl3-/-小鼠及其同窝野生对照小鼠的脾脏及胸腺中不同亚型T细胞比例的分析发现，Ormdl3-/-小鼠脾脏CD4+CD8-及CD4-CD8+T细胞比例与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。此外，我们又对同批次小鼠骨髓及脾脏淋巴细胞中各亚型B细胞比例进行了分析。结果显示，骨髓祖B细胞(Pro-B，B220+CD43+)和前B细胞（Pre-B，B220+CD43-）在Ormdl3敲除小鼠及野生对照小鼠间并无统计学差异（P＞0.05）。然而，Ormdl3基因敲除小鼠脾脏总B细胞(CD19+)、成熟B细胞(Mature B，CD19+IgM+IgDhi)和过渡2型B细胞(Transitional2 B，T2B，CD19+IgMhiIgDhi)比例相较于同窝野生对照小鼠显著下降(P＜0.05)，脾脏T1型B细胞(T1B，CD19+IgMhiIgDlo)及骨髓相应B细胞比例在两者间无统计学差异。由于骨髓及脾脏中成熟和未成熟B细胞都是从骨髓祖B细胞分化发育而来的，因此以上结果提示Ormdl3可能在B细胞由骨髓迁出及向外周淋巴器官迁入过程中出现调控失常，从而导致脾脏各型B细胞比例失调。由于脾脏T1B细胞向T2B细胞发育过程很大程度上取决于B细胞激活因子BAFF的作用，因此我们又对两种基因型小鼠Baff的表达进行了检测，结果显示缺失Ormdl3可显著降低小鼠脾脏淋巴细胞中Baff的表达水平及Baff的血清浓度，与此同时血清中免疫球蛋白IgM和IgG的分泌也显著降低，提示Ormdl3可能通过调控Baff的表达影响脾脏B细胞的发育存活。此外，在对野生小鼠骨髓及脾脏不同阶段B细胞中Ormdl3的表达差异分析显示，Ormdl3在骨髓和脾脏各期B细胞中表达均较高，且在脾脏Immature B细胞阶段表达达到峰值，随后表达下降，这可能是缺失Ormdl3后对未成熟和成熟B细胞影响最大的主要原因。另外，我们在对6-24周龄成年小鼠腹腔灌注液中不同亚型B1细胞比例的分析中发现，Ormdl3基因敲除小鼠腹腔B1a(B220loCD5+)细胞比例与野生小鼠相比具有显著性差异(P＜0.05)，而B1b(B220loCD5-)细胞比例在两者间并无差异。
　　接下来同样利用流式细胞仪检测了6-8周龄成年Ormdl3基因敲除小鼠与野生小鼠脾脏细胞周期分布情况及细胞增殖变化。结果显示，Ormdl3基因敲除对小鼠淋巴细胞周期并无改变，同时也不影响B淋巴细胞增殖水平。此外，发现Ormdl3敲除小鼠脾脏中总淋巴细胞及CD19+B细胞凋亡水平均显著升高，与野生小鼠相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。骨髓总淋巴细胞和CD19+B细胞的凋亡水平在两者间无显著差别，这可能是造成小鼠脾脏成熟及未成熟B细胞数量降低的原因之一。
　　鉴于ORMDL3对B细胞发育及存活的影响，我们认为缺失Ormdl3后可能会缓解狼疮小鼠的部分表型。为此，我们通过向野生小鼠和Ormdl3敲除小鼠腹腔一次性注射Pristane0.5ml的方法建立了Pristane诱导的狼疮小鼠模型。与注射Pristane的野生小鼠相比，Pristane诱导的Ormdl3基因敲除小鼠脾脏肿大现象得到明显抑制，尿蛋白水平有所降低，肾脏病理损伤较轻，CD4+/CD8+细胞比例升高不明显。虽然这些表型还不足以证实Ormdl3敲除后对狼疮小鼠的治疗作用，但初步提示ORMDL3可能在导致SLE发病过程中具有一定作用。
　　综上，通过该部分的实验成功构建了Ormdl3基因敲除小鼠及Pristane诱导的狼疮小鼠模型。通过对小鼠表型的分析发现，Ormdl3可能主要影响了脾脏B细胞的发育。此外，通过对Pristane诱导Ormdl3敲除狼疮小鼠表型的部分研究，初步提示缺失ORMDL3可能作为新的靶点对SLE起到一定治疗作用。
　　第二部分 ORMDL3能够促进细胞自噬水平并抵抗细胞凋亡
　　首先，利用病毒载体建立了高表达和低表达ORMDL3的稳筛Raji细胞系，并通过Western-blot检测自噬相关蛋白的表达情况。结果显示，ORMDL3能够显著促进自噬相关基因Beclin1和LC3Ⅱ的表达，且这种促进作用呈现一定的剂量及时间依赖性。随后，我们在Ormdl3基因敲除小鼠模型中的验证分析证实了以上结果，即缺失Ormdl3后可显著降低Beclin1及Lc3Ⅱ的表达水平，但并不影响Atg5的表达。
　　利用免疫荧光实验对过表达ORMDL3的HEK293细胞内LC3荧光焦点的形成情况进行了检测。结果显示不论是外源性还是内源性LC3荧光焦点，在过表达ORMDL3的细胞内其数量均显著高于对照细胞。此外，还利用电子显微镜对过表达ORMDL3的Raji细胞和HEK293细胞及其对照细胞内自噬体的数量进行检测，结果与前相一致，即过表达ORMDL3后细胞质内自噬体的数目相较于对照而言显著增多，包括自噬体及自噬性溶酶体。至此，基本证实ORMDL3能够正向调控细胞自噬水平。
　　利用小干扰RNA分别抑制Beclin1和ATG5在过表达ORMDL3的HEK293细胞及其对照细胞中的表达。结果显示，抑制Beclin1和ATG5的表达后，ORMDL3促进LC3Ⅱ/Ⅰ增高的趋势得到有效逆转，且这种作用主要是通过影响Beclin1的表达来实现的。
　　在明确ORMDL3对自噬的作用之后，我们又在Raji细胞中检测了ORMDL3对凋亡的影响。结果显示，ORMDL3能够显著抑制Caspase3、Caspase9及PARP的裂解后活性片段的表达，且流式细胞检测结果与之相一致。与之相印证的是，我们在对Ormdl3基因敲除小鼠脾脏淋巴细胞及B细胞进行的Western-blot实验中发现了相同的结果，进一步证实ORMDL3对细胞命运而言存在着促自噬抑凋亡的作用。由此，我们判断ORMDL3可能是通过促进细胞自噬而达到抑制细胞凋亡的目的，进而起到维持细胞内环境稳定的作用。以上结果也可以部分解释Ormdl3基因敲除小鼠脾脏淋巴细胞及B细胞比例下降的原因。
　　综上，通过以上实验得出结论:ORMDL3能够通过促进细胞自噬，抑制细胞凋亡，进而维持细胞的正常存活。
　　第三部分 ORMDL3通过上调ATF6表达促进细胞自噬发生
　　首先，利用过表达ORMDL3和低表达ORMDL3的Raji细胞系分别检测了ERS通路中相关基因的mRNA表达量。结果显示过表达ORMDL3后能够显著促进内质网分子伴侣BiP(Binding protein)的表达，同时Ormdl3基因敲除小鼠脾脏淋巴细胞中bip的mRNA表达量也显著降低，验证前人有关ORMDL3对ERS的激活作用。其次，通过实时定量结果证实，ORMDL3主要通过ATF6通路介导ERS的发生，而对PERK和IRE1-XBP1通路则无作用或作用不显著。Western-blot结果显示，ORMDL3能够促进ATF6(90KDa)的表达并促进其裂解为ATF6(50KDa)片段。而在此过程中，ORMDL3并不影响磷酸化eIF2α的表达及XBP1的剪切。小鼠模型体内实验结果与之相一致。
　　为了明确ORMDL3对ATF6的调控作用，接下来我们又利用过表达ORMDL3的HEK293细胞，通过免疫荧光实验对ORMDL3影响ATF6入核的作用进行了分析。结果显示，与对照细胞相比，过表达ORMDL3的细胞中ATF6的入核现象显著增高，当叠加了ERS诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin，TG)的作用之后，这种现象更为明显，进一步证实ORMDL3可以通过ATF6的作用介导ERS的发生。
　　最后，进行了拯救实验，即在低表达ORMDL3的HEK293细胞系内瞬转入pEGFP-ORMDL3表达载体，在补充ORMDL3的表达后检测ATF6及自噬相关基因表达的变化情况。结果显示，当向shORMDL3的HEK293细胞内补充pEGFP-ORMDL3后，shORMDL3导致ATF6下调及Beclin1和LC3Ⅱ表达降低的趋势得到有效逆转，自噬水平得到明显提升。同时免疫荧光实验的结果也支持以上结论，证实ORMDL3对细胞自噬的促进作用至少可部分通过ATF6的介导实现。此外，还发现ORMDL3的刺激因子—IL4/IL13在促进ORMDL3表达升高的同时，IL13还有一定的促自噬抑凋亡作用，但其对自噬及凋亡的调控作用是否有可能通过ORMDL3介导仍需更深一步的研究。
　　综上，通过以上实验证实ORMDL3对自噬的促进作用是通过上调ERS中的ATF6通路的表达实现的。

目录

声明

摘要

缩略语表

前言

第一部分 Ormdl3基因敲除小鼠及Pristane诱导狼疮小鼠模型的构建及表型分析

材料和方法

结果

讨论

第二部分 ORMDL3能够促进细胞自噬水平并抵抗细胞凋亡

材料和方法

结果

讨论

第三部分 ORMDL3通过上调ATF6表达促进细胞自噬发生

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

综述：细胞自噬与免疫及自身免疫关系的研究进展

攻读学位期间主持的科研项目

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英文论文Ⅱ