Sohlh2通过Wnt/β-Catenin信号通路抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移

摘要

研究目的：结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。在欧美发达国家，结肠癌是发病率排名前三的恶性肿瘤，更是美国男性、女性癌症死亡的第三大原因。近年来，在我国，随着经济水平的提高，东西方文化交流的增加，人们的生活方式、生活习惯都发生了很大的变化，导致我国结肠癌的发病率显著上升。
　　结肠癌是一种多因素多机制作用导致的恶性疾病，它的影响因素遍布我们生活的各个方面，故在防治方面增加了难度。但是结肠癌发展缓慢，早期治愈率高，5年生存率达到90％以上。所以加强对结肠癌的研究，不断探索出更多更好的早期筛查和诊断的方法，对于结肠癌的早期诊断、及时治疗以及预后改善都具有很大的意义。
　　Wnt/β-catenin信号通路的高度激活可以促进细胞的增殖和生长，是很多肿瘤细胞（尤其是结肠癌细胞）发生发展的重要的调节途径。90％以上的结肠癌患者都有Wnt/β-catenin信号通路中关键调节因子的变性。这些或正或负调节因子的变性最终都会引起β-catenin的入核增加，进入核内的β-catenin可以与核内的TCF/LEF转录因子形成复合体，促进下游靶基因c-myc、cyclinD1等表达的增加，进而促进细胞的增殖和细胞形态的改变，导致肿瘤的发生。
　　Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factor2)作为一种bHLH转录因子主要调节小鼠生殖细胞的分化。然而Sohlh2在正常的人体组织中呈现较高水平的表达，而在很多的肿瘤细胞中表达较低。其中，在卵巢癌细胞中，它可以下调cyclinD1、mmp9等对肿瘤细胞有促进作用的分子的表达，抑制卵巢癌细胞的增殖和转移。Sohlh2在结直肠癌中的表达也是明显降低的，但是Sohlh2对结肠癌细胞的作用及其机制尚未有人研究。
　　我们的研究就是通过检测Sohlh2在结肠癌细胞中的表达情况，发现Sohlh2与结肠癌细胞发生发展的关系。利用MTT、BrdU、克隆形成、FACS、Transwell、Matrigel、划痕实验、裸鼠皮下成瘤及远处转移、实时定量PCR、Western Blot、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、细胞转染等实验技术，检测Sohlh2对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移的影响，并进一步探索Sohlh2发挥作用的机制。Sohlh2可能成为结肠癌诊断和治疗的新的靶点。
　　研究方法：
　　1.检测结肠癌组织中Sohlh2的表达
　　取不同分级的临床结肠癌患者标本，制备组织芯片并进行免疫组织化学染色，观察分析正常结肠组织、结肠癌Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组织中Sohlh2的表达。
　　2.检测Sohlh2对结肠癌细胞增殖的影响
　　培养结肠癌细胞系LoVo，采用细胞转染技术，分别将Sohlh2质粒、空质粒、Sohlh2RNAi、非特异性RNAi转染进LoVo细胞，将细胞分为①空质粒+Control组（Con组）;②Sohlh2质粒+Control组（P-Sohlh2组）;③非特异性RNAi+Control组(si-Con组);④Sohlh2RNAi+Control组（si-Sohlh2组）四个组，前两组用800μg/mlG418，后两组用3μg/ml pd，筛选两周，建立稳转的细胞系。分别通过MTT、克隆形成、BrdU、FACS等几种实验方法检测四组细胞增殖能力的强弱。
　　3.检测Sohlh2对结肠癌细胞迁移、侵袭的影响
　　用第2步所建立的四组细胞系，分别进行细胞划痕实验、Transwell及Matrigel基质胶侵袭实验，通过这几种实验方法，分别检测四组细胞的迁移和侵袭能力的不同。
　　4.检测Sohlh2对结肠癌细胞皮下成瘤及远处转移的影响
　　收集四组细胞，每组细胞对应5只裸鼠，进行裸鼠皮下注射，定期观察肿瘤的长出情况，待四组细胞肿瘤都有长出时，间隔测量肿瘤大小，最后取出肿瘤，称取瘤重，固定，石蜡包埋，以备后续免疫组织化学染色实验使用。准备细胞和裸鼠同前，对裸鼠进行尾静脉注射，2个月后，脱颈处死小鼠，取出肝、肺组织固定，石蜡包埋，5μm厚度切片，然后通过H&E染色，检测肿瘤肝、肺转移情况。
　　5.探讨Sohlh2对Wnt/β-catenin信号通路的调控
　　(1)用实时荧光定量PCR法检测四组细胞中c-myc、cyclinD1、mmp9、lgr5基因在mRNA水平的表达，通过免疫荧光、Western Blot实验方法进一步检测四组细胞中上cyclinD1、c-myc基因在蛋白水平的表达。
　　(2)对临床结肠组织进行β-catenin的免疫组织化学染色，观察β-catenin在正常结肠组织和结肠癌组织细胞中的表达情况，以及与Sohlh2表达的关系。收集①②组细胞，提取核蛋白，通过Western Blot的实验方法检测核内β-catenin蛋白表达的差异。通过对细胞爬片的免疫荧光染色，观察β-catenin在四组细胞中的表达位点及表达量的不同。对第4步中的由Con组细胞和P-Sohlh2组细胞形成的肿瘤组织切片进行免疫组织化学染色，检测两组细胞形成的肿瘤组织中β-catenin和Sohlh2的表达情况。
　　(3)将细胞重新分成以下四组:空质粒+Control组（Con组）;Sohlh2质粒+Control组（P-Sohlh2组）;空质粒+Control+Licl组（Con+Licl组）;Sohlh2质粒+Control+Licl组（Sohlh2+Licl组），Licl使用浓度是10mmol/L，作用24小时后，采用实时荧光定量PCR检测四组细胞中c-myc、cyclinD1、mmp9、lgr5基因在mRNA水平的表达，通过BrdU实验方法检测细胞的增殖能力的变化，再通过免疫荧光染色、Western Blot的实验方法检测四组细胞中Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因c-myc、cyclinD1在蛋白水平表达的不同。
　　研究结果：
　　1、临床标本的免疫组织化学染色结果显示，Sohlh2在细胞核和细胞质中都有表达。Sohlh2在正常结肠组织中呈现较高的表达，在结肠癌中表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05)。而且随着结肠癌分级的增加，肿瘤分化程度的减弱，Sohlh2的表达呈现递减的趋势。
　　2、与Con组相比，P-Sohlh2组在24h，48h，72h时的OD(490)明显减少(P＜0.01)，相反si-Sohlh2组比si-Con组的OD(490)明显增加，说明Sohlh2抑制结肠癌细胞的增殖。BrdU实验结果也显示，Sohlh2过表达明显抑制结肠癌细胞阳性细胞数（P＜0.01），而Sohlh2 RNAi干扰了Sohlh2的作用使阳性细胞数明显增加（P＜0.01）。克隆形成实验中P-Sohlh2组细胞克隆的数目明显少于Con组（P＜0.01)的实验结果进一步揭示Sohlh2对结肠癌细胞克隆形成的抑制作用。流式细胞周期检测实验非常直观的显示P-Sohlh2组细胞被阻滞在G0/G1期，而si-Sohlh2组细胞G2/S期细胞明显增加。
　　3、细胞划痕实验结果显示，Sohlh2过表达以后细胞的迁移率与Con组相比明显降低（P＜0.05），si-Sohlh2组细胞的迁移率与si-Con组相比则明显上升（P＜0.05）。Transwell实验中P-Sohlh2组穿过小室的细胞数目明显减少(P＜0.01)，而si-Sohlh2组穿过的细胞显著增多（P＜0.01）。Matrigel基质胶实验结果进一步说明Sohlh2不仅抑制结肠癌的迁移，还抑制结肠癌细胞的侵袭:Sohlh2过表达以后穿过基质胶进入小室膜底部的细胞明显减少（P＜0.05），小RNA干扰Sohlh2的表达以后，穿过的细胞明显增多（P＜0.01）。
　　4、裸鼠皮下成瘤实验通过在体实验进一步证实了Sohlh2抑制结肠癌细胞的增殖，从而抑制了皮下肿瘤的生长速度。由肿瘤生长曲线和瘤重柱状图结果可以看出，Sohlh2的表达增加，肿瘤生长速度减慢，取得的肿瘤重量较轻，相反，Sohlh2的表达降低，肿瘤生长速度加快，最终的瘤重偏重。裸鼠尾静脉注射远处转移实验结果发现，Sohlh2可以明显抑制结肠癌细胞的肺组织转移（P＜0.01）;相反，抑制Sohlh2可以明显促进结肠癌细胞的肺转移（P＜0.01）。未见明显肝转移灶。
　　5、Sohlh2过表达以后，Wnt/β-catenin信号通路的靶基因c-myc、cyclinD1、mmp9的表达无论在mRNA水平还是在蛋白水平都明显受到抑制，lgr5的mRNA的表达也减少。免疫组化和Western Blot结果显示Sohlh2与β-catenin的核内表达成负相关。加入Licl可以激活Wnt/β-catenin信号通路，使c-myc、cyclinD1、mmp9、lgr5的mRNA的表达及c-myc、cyclinD1蛋白表达增加，细胞增殖能力增强，而Sohlh2可以抑制Licl的激活作用。
　　结论：
　　1、Sohlh2抑制结肠癌的增殖、迁移、侵袭和转移。
　　2、Sohlh2可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活发挥作用。

目录

声明

摘要

符号说明(按英文字母先后排序)

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、统计学处理

实验结果

一、Sohlh2在结肠癌组织中表达降低

二、Sohlh2抑制结肠癌细胞的增殖

三、Sohlh2抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭

四、Sohlh2抑制结肠癌细胞形成皮下肿瘤

五、Sohlh2抑制结肠癌细胞远处转移

六、Sohlh2抑制Wnt／β-catenin信号通路的激活

讨论

实验结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文